2016 Fiscal Year Research-status Report
白内障の病態形成に関わるアスパラギン酸異性化メカニズムの解明
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16K16605
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| Research Institution | International University of Health and Welfare |
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Principal Investigator |
坂上 弘明 国際医療福祉大学, 薬学部, 助教 (80734855)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | D-アミノ酸 / 紫外線 / タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質を構成するアミノ酸は通常、全てL型であるが、加齢に伴ってアスパラギン酸(Asp)残基がL型からD型へ異性化することが明らかとなっている。特に水晶体の主要構成タンパク質であるクリスタリンでは、特定のAsp残基が著しく異性化する事が知られており、Asp残基の異性化と白内障発症との間に因果関係が示唆されている。
Aspの異性化反応は加齢に伴って徐々に進行するほか、紫外線照射によって促進する事が先行の統計調査によって明らかとなっている。しかしながら、Asp残基は紫外線を吸収しないため、なぜ紫外線の曝露によって異性化反応が促進するのか、また加齢によるAsp異性化反応が限られたAsp残基にしか生じないなど、Aspの異性化メカニズムは不明な点が多く残されている。
そこで本研究では、紫外線によるAspの異性化促進反応のメカニズム、および加齢による部位特異的なAsp異性化反応メカニズムを解明することを目的とした。また、グルタミン酸(Glu)においても、近年Asp同様に異性化反応が生じることが報告されていることから、本年度は、AspおよびGluの異性化反応メカニズムを同時に解析する方法の構築に取り組んだ。
Aspの異性体には、Lα、Lβ、Dα、Dβの4つの異性体が、Gluの異性体にはLα、Lγ、Dα、Dγの4つの異性体が存在している。AspおよびGluを1残基ずつ有するペプチドのうち、AspおよびGluをそれぞれ4つの異性体に置換したペプチド計16種類を合成し、逆相クロマトグラフィーによってペプチドの分離を行った。現在の所、13個のピークに分離することに成功している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度はAsp/Gluの異性化分析法の構築に取り組んだ。現在までに異性化促進メカニズム解明のために必要な分析法をある程度確立できたため、このAsp/Glu異性化分析法を用いて、紫外線によるペプチド中Asp/Gluの異性化の促進について検討を行った。先行研究では、トリプトファン(Trp)がAsp残基のC末端側隣接残基に存在する場合、有意にAspの異性化反応を促進する事が明らかとなっている。本研究では、遊離Trpを溶解させたペプチド溶液に紫外線を照射することで、ペプチド結合を介さずにTrpがAsp異性化反応を促進するのか検討を行った。紫外線照射の結果、ペプチドの分解やカルボニル化と思われる様々な反応がペプチドに生じていることが分かったものの、Asp/Gluが異性化しているような有益な情報は得られなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
Asp/Gluの異性化が検出できなかった一つの要因として、照射紫外線量の調節が難しかった点が挙げられる。紫外線照射後のペプチド溶液では、遊離Trpの分解が著しく進行しており、Asp/Gluの異性化が進行するより前にTrpが分解された可能性がある。低線量の紫外線を長時間照射することでAsp/Glu異性化反応が促進しないか検討する。また、TrpとAsp/Gluが空間的に近接するような環状ペプチドを化学合成した後、紫外線を照射することでAsp/Glu異性化反応が促進するのかを検討する。以上に加え、紫外線非照射条件下におけるAsp異性化メカニズムの解明にも着手する。
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| Causes of Carryover |
Asp異性体の分析手法の開発に手間取ったことや、紫外線による異性化促進反応が顕著に見られなかったことで研究の進捗に遅れが生じた。このため、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
Asp/Gluの異性化分析に必要な逆相カラムの購入、TrpとAsp/Gluが空間上近接するような環状ペプチドの合成に必要な合成試薬・器具の購入、情報収集のための学会出張費に使用する。
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