2017 Fiscal Year Research-status Report
細胞間相互作用を可視化する糖修飾蛍光プローブのin silico探索と合成
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16K16640
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
金森 功吏 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (90633446)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 蛍光プローブ / レクチン / GFP / turn-on |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、細胞表面に存在する糖鎖受容体であるセレクチンと、そのリガンドである糖鎖を介した細胞間相互作用の可視化を目指し、セレクチンに結合して蛍光性に変化する糖修飾蛍光プローブの設計と合成を目指している。
前年度までに、GFP色素誘導体並びに単糖ユニットを結合させた糖修飾蛍光プローブの基本骨格の設計と合成を行った。続いて、プロトタイプの糖修飾蛍光プローブを用いて細胞上のレクチンに対して蛍光応答を調べた。共焦点レーザー顕微鏡を用いて蛍光シグナルを観察したところ、予期に反して蛍光応答が観察されない結果となった。
そこで2017年度は、当初の計画を一部変更し、ペプチドを基本骨格としてGFP色素誘導体を導入した種々の蛍光プローブを設計・合成し、モデルレクチンとしてコンカナバリンAを用いた蛍光応答評価を行い、コンセプトの証明を試みた。その結果、タンパク質レベルにおいて、レクチンに結合して弱蛍光状態から6倍に蛍光強度が増大する糖修飾蛍光プローブの開発に成功した。これらの成果を、日本化学会第98春季年会(2018)にて口頭発表した。
現在は、このプローブ設計法を、細胞上のレクチン検出へ適用することを目指して研究を進めている。具体的には、蛍光応答を増強させるためランダムアミノ酸配列を導入した蛍光プローブライブラリーの合成を行うとともに、蛍光応答にすぐれた最適の配列の探索を進めている。さらに、in silicoによる蛍光プローブの構造探索を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初は、細胞表面の糖鎖受容体であるセレクチンに対するturn-on型蛍光プローブの設計と合成を行っていたが、プロトタイプの蛍光プローブを細胞に対して用いて蛍光応答評価を行ったところ、蛍光応答は観測されなかった。そこで、モデルレクチンとしてコンカナバリンA(ConA)を用い、タンパク質レベルで本研究のコンセプトの実証を試みた。その結果、ペプチド骨格を用いて系統的に構造を変化させた蛍光プローブライブラリーを用いたところ、ConA添加に伴い、6倍蛍光強度が増大するturn-on型蛍光プローブの探索に成功した。この結果を踏まえ、現在、turn-on型蛍光プローブライブラリーの合成と細胞を用いた蛍光応答評価を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在までに、モデルレクチンとしてConAを用いたturn-on型蛍光プローブの開発に成功している。この蛍光プローブの開発手法を用い、今後は細胞表面のセレクチンを始めとした糖鎖受容体のプローブ設計と合成ならびに蛍光応答評価を進めていく予定である。
具体的には、プローブにランダムアミノ酸配列を導入したライブラリーを作成し、デコンボリューション法を用いて最適配列の探索を行うとともに、in silicoによる構造探索を進めていく予定である。また、導入する蛍光色素誘導体を種々合成し構造活性相関を行って、蛍光応答に優れたプローブの探索を行っていく予定である。
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| Causes of Carryover |
当初の計画である、細胞を用いた蛍光プローブの蛍光応答実験の結果、蛍光応答が見られなかったため計画を一部変更し、タンパク質レベルでプローブ設計を検討し直した。そのため、当初の計画から差額が生じ繰越が生じた。
今後は、繰越金を利用して、これまでにタンパク質レベルで成功したプローブ設計法を応用し、細胞レベルでの実験を再度行っていく。
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