2016 Fiscal Year Research-status Report
協奏的な分子認識に伴う自己組織系のミクロ・マクロ特性評価
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16K18279
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
菅 恵嗣 大阪大学, 基礎工学研究科, 助教 (00709800)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | リポソーム / 単分子膜 / 分子認識 / アミノ酸 / 核酸 / ナノドメイン / 膜特性解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
H28年度は、主に単分子膜ならびにリポソーム膜を用いて脂質膜ドメインのナノ構造解析を行った．DPPC脂質に脂肪酸（オレイン酸）を添加した際のπ-A等温線ならびに表面力測定解析より、オレイン酸分子が膜の秩序構造を乱し膜内部の疎水場を暴露させる事を明らかにした(BBA-Biomembranes, 1859, 211-217 (2017))．
リポソーム膜状におけるナノドメイン形成挙動についても検討を行った．コレステロール(Chol)誘導体（Chol、Erg、Lan）の場合、Cholでは秩序相の形成が見られたが、ErgやLanでは秩序相形成がほとんどみられなかった（Langmuir, 32 (24), 6176-6184 (2016)）．さらに、Chol誘導体であるDC-Cholにおいても同様にナノドメインが形成される事を明らかにした．DC-Chol分子は正電荷脂質であるため，膜上のDC-Cholドメインは非ドメイン領域と比較して約6倍の電化密度を有する事を明らかにした(Langmuir, 32, 3630-3636 (2016))．
分子認識については，主にリポソームによる核酸(tRNA)，アミノ酸の選択的な吸着挙動について検討を行った．核酸(例：tRNA)を認識する膜場設計として，グアニジニウム修飾リポソームを調製し，従来の正電荷リポソームと比べ，約10倍程度の結合乗数を示す事を明らかにした．さらに，リポソームによって認識されたtRNAは，加熱によって工事構造変化を誘導した際に，C-G塩基が選択的に開裂する挙動を示した（J. Phys. Chem. B, 120 (25), 5662-5669 (2016)）．アミノ酸認識において，不均一膜の相境界においてL-アミノ酸認識が促進される事を明らかにした（Langmuir, 32 (24), 6011-6019 (2016)）．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H28年度の目標である，自己組織化膜のミクロ環境に関する特性解析手法は概ね確立できたと考えられる．単分子膜に関して，πーA等温線より分子占有面積，圧縮率を解析する事で脂質分子間相互作用を見積る事ができる．リポソーム膜の場合，蛍光プローブ(TMA-DPH，Prodan，ANS，Laurdan，DPH)を利用して膜深度の異なる領域の特性を多焦点的(Multi-level)に比較する手法を開発した(Langmuir, 32 (24), 6176-6184 (2016))．また，従来のゼータ電位測定では膜のミクロ相分離を反映した電荷密度解析は困難であったが，蛍光プローブHHCにより膜表層の局所的な静電ポテンシャルを解析する手法を開発した（Langmuir, 32, 3630-3636 (2016)）．
分子認識については，主にリポソームを基盤とする分子認識機構の解明に成功した．アミノ酸や核酸の吸着選択性を向上させる鍵となる要素は，ナノドメインならびに相境界である．従来では，経験的に不均一リポソームが分子認識に応用されてきたが，本研究では界面長という概念を導入し，不均一膜ドメインの周囲界面長を定量的に評価した．結果，L-His認識において，界面長と吸着速度に比例関係がある事を初めて明らかにした．グアニジニウム基による核酸認識において，グアニジニウムリガンドが膜上で秩序相を形成する事を明らかにした．このとき，室温ではtRNA分子の構造に影響はないものの，高温（60℃）ではドメイン構造が崩壊し，それに伴って認識したtRNA分子の特異的な構造変化を誘導する事がわかった．
以上より，膜設計ならびに分子認識への応用という課題は概ね達成できていると考えられる．
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| Strategy for Future Research Activity |
継続して，自己組織化膜のミクロ相分離構造の評価手法を発展させる．H28年度は主に秩序相の特性解析に特化した評価手法の確立であったが，H29年度以降は無秩序相に関する情報も集約し，膜表層全体のミクロ特性を反映させた相図の解明に取り組む．LaurdanやProdanはミクロ誘電環境に応答して異なる蛍光ピークを有する．得られたスペクトルをデコンボリューション解析すれば，膜表層における秩序相/無秩序相の相分離比に基づくタイラインが描写できる．分子認識に伴う相分離比の変化を詳細に検討すれば，認識に伴うエントロピーを評価可能である．
これまでは主に二次元膜界面における分子認識挙動に注目してきたが，今後は水中における三次元的な分子認識についても検討を行う．そのための材料設計として，1)金属ナノ材料担持型脂質膜，2)三次元的な脂質膜ネットワーク（cubic相(cubosome))の設計を行う．
１）金属ナノ粒子はそれぞれ特有のプラズモン吸収を有するため，表面増強ラマン分光法(SERS)への応用が期待される．これまでに，金ナノ粒子担持型脂質膜の凝集によってSERSが得られる事を明らかにしている．これらの知見を応用し，膜の二次元界面における対象分子（例：アミロイドβ））の認識性を高め，さらに三次元的に対象分子を包摂する様な凝集構造を設計する．生体分子の高次構造を認識する事は依然として課題であるが，膜を修飾したナノ材料によって包摂構造を制御できれば，新たな検出・分離技術への貢献が期待される．
２）連続的な膜構造を有するcubic相について，先行段階ではあるが研究に着手している．オレイン酸/モノオレイン分散系のpHを5.0に調整する事で，ゲル状のcubic相が得られる事を明かにしている．一方，その膜構造などは未解明の部分が多いため，ラマン分光や傾向プローブ法を活用して特性解析を行う．
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