2016 Fiscal Year Research-status Report

環境感知による樹状突起空間パターニング制御機構の解析

Research Project

Project/Area Number	16K18363
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	藤島和人京都大学, 物質－細胞統合システム拠点, 特定助教 (20525852)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	神経発生 / 樹状突起形成 / フィロポディア
Outline of Annual Research Achievements	本年度は以下の二つの項目に関して研究を行った。 (1)フィロポディア長さ制御と樹状突起の空間充填パターンの解析本年度はMtss1欠損によるフィロポディアの過伸長が引き起こされる分子メカニズムの解析を行った。Mtss1が分岐型/束化型アクチンのバランスを制御することでフィロポディア長を調整している可能性があった。共免疫沈降によりMtss1が束化型アクチン形成を誘導するforminと相互作用することを確認した。さらに活性化型forminによるFアクチン量の増加が、Mtss1の共発現により抑制されることが示されつつある。またMtss1の機能抑制と同様に活性化型forminの強制発現でも、フィロポディアの過伸長が誘導された。mtss1はforminの活性を抑えることで樹状突起フィロポディアの長さ調整に関与する可能性が示唆された。 (2)フィロポディアによる樹状突起の方向性制御の解析本年度は平行線維の方向性に依存した樹状突起の成長形式を、経時観察した。直交性制御因子 (Spectrin betaIIIや myosinIIB) の阻害下で樹状突起の成長ダイナミクスを解析したところ、特に進展方向が乱れることがわかった。さらに阻害下では樹状突起フィロポディアのダイナミクスも変動する傾向にあった。フィロポディアによる平行線維の認識が損なわれた可能性がある。さらにプルキンエ細胞樹状突起による平行線維の認識機構を調べるため、分子の同定を試みた。プルキンエ細胞-平行線維間のシナプス形成に関わり、Spectrin beta IIIとの相互作用が知られている接着関連因子に着目した。この分子を通常平行線維に対して方向性を示さない顆粒細胞樹状突起に異所発現させると、直交性を獲得するようになった。しかし、プルキンエ細胞で発現阻害しても影響がなかった。類縁の分子が相補的に働いている可能性が考えられる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason (1)フィロポディア長さ制御と樹状突起の空間充填パターンの解析 Mtss1はこれまでにArp2/3などを介した分岐型アクチンの形成にかかわることが知られていた。本研究ではMtss1はforminと結合しそれを阻害することにより、束化型アクチン重合を阻害する可能性が示唆された。Mtss1が分岐型/束化アクチンのバランスを制御するという仮説の裏付けの一つとなりうるデータを得ることができた。今後、セルフリーシステムでのアクチン重合アッセイなどを行い、より詳しい制御メカニズムを明らかにしていく予定である。またmtss1の発現阻害と活性型forminの過剰発現はともにプルキンエ細胞樹状突起のフィロポディアの過伸長を誘導することを確認している。生体内のプルキンエ細胞樹状突起のフィロポディア形成または樹状突起の三次元構造にどのように影響が出るか、mtss1のノックアウト動物での表現型と比較しつつ解析したい。さらに、フィロポディア長と樹状突起の空間分布に因果関係が存在するかどうか、以前作成した樹状突起形成を再現する数理シミュレーションを用いて、特に接触依存的退縮に着目しながら解析する。 (2)フィロポディアによる樹状突起の方向性制御の解析これまでに、平行線維の方向性に依存した樹状突起の成長形式を、経時観察した。通常時および直交性制御因子阻害時における樹状突起形成ダイナミクスを解析することができた。阻害時には成長方向に乱れが生じることが明らかになった。平行線維を認識する接着関連因子に着目し、この分子が直交性に一定の関与を示す可能性が示された。しかし、プルキンエ細胞においてはほかの分子が相補的に働く可能性もまた同時に浮上した。今後も引き続き因子の同定を試みる。
Strategy for Future Research Activity	(1)フィロポディア長さ制御と樹状突起の空間充填パターンの解析本年度ではMtss1がforminの活性をどのように制御しているのかを詳しく解析する。スペックル顕微鏡を用いて、細胞内で蛍光ラベルした少数のforminを蛍光ラベルしその動態からforminの重合能を解析する。Mtss1存在下でforminによる重合能が変化するかどうか確認する。同時にセルフリーシステムによるアクチン重合アッセイを行うことにより、Mtss1とforminの関係を解析することも検討している。forminの樹状突起・フィロポディア形成における働きに関しては、過剰発現による効果しか観察できていない。機能阻害実験を行うためにshRNAまたはCrispr/Cas9を用いた発現阻害を試みる。さらにMtss1欠損による樹状突起の空間分布の変化が、フィロポディア過伸長に起因した過剰な接触依存的退縮によるものであるかどうか検討する。申請者がこれまでに行った樹状突起形成のシミュレーションを用いてフィロポディア長と樹状突起パターニングの因果関係を解析する。またMtss1ノックアウト動物にformin阻害を行い表現型が回復するかどうか、フィロポディア長および樹状突起の二次元的・三次元的空間分布に注目し確認する。 (2)フィロポディアによる樹状突起の方向性制御の解析これまで得られつつある、樹状突起やフィロポディアのダイナミクス解析を引き続き執り行い、データの拡充を図る。平行線維の認識および樹状突起方向制御に関与する分子をさらに同定する。同定が成功した場合、フィロポディアの方向決定のメカニズムを解析するために、その制御因子群がフィロポディア形成の際にどのような挙動を示すか観察し、フィロポディアのダイナミクスとの関連性を解析する。また三次元培養を試み、軸索-樹状突起の直交性が平面形成を誘導しうるか確認する。