2016 Fiscal Year Research-status Report
超解像によるNMDA受容体サブユニット局在調整機構解析
| Project/Area Number |
16K18376
|
|---|
| Research Institution | Gunma University |
|---|
Principal Investigator |
小金澤 紀子 群馬大学, 大学院医学系研究科, 助教 (90643114)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | NMDA型受容体 / ドレブリン / 樹状突起スパイン / 超解像顕微鏡 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
高次脳機能の実現において重要な役割を果たす要素の一つであるNMDA型グルタミン酸受容体は様々なサブユニットを持ち、各サブユニットの局在変化がシナプス機能・可塑性へ影響を及ぼすことが知られている。本研究では樹状突起スパインにおける各サブユニットの局在の経時変化を明らかにすると同時に、神経活動依存的にその局在を変えるドレブリンやシナプス足場タンパク質との相互関係を明らかにすることを目的としている。ドレブリンはNMDA受容体サブユニット輸送を制御する要因の１つである可能性が考えられており、本研究では特に超解像顕微鏡を用いて樹状突起スパインという微小環境における受容体やドレブリンの局在について着目する。さらに、ヒトiPS細胞由来神経細胞についてもNMDA受容体サブユニット等の局在解析を目指し、種差を超えた共通のシナプス機能機構の解明につなげたい。そのためには、ヒトiPS細胞由来神経細胞の培養方法を確立させていくことも重要である。
これまでに、NMDA型グルタミン酸受容体サブユニットの発現についてドレブリンノックアウト動物を用いた検証を行ってきた。ドレブリンはE型アイソフォームとA型アイソフォームがあるが、A型アイソフォーム特異的ノックアウト動物（DAKO）と、E型・A型両アイソフォームノックアウト動物（DXKO）を通常個体（WT）と比較することにより、NMDAR各サブユニットとドレブリンE型・A型アイソフォームとの相互関係を概観してきた。各マウス（WT、DAKO、DXKO）から調整した初代培養神経細胞を用いて経時的に各サブユニットの発現数を計測した。また、超解像顕微鏡による局在解析を行うための色素等も検討し、様々なシナプスタンパク質（ドレブリン、シナプシンI、PSD-95）の局在解析が進んでいる。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに、①NMDA型グルタミン酸受容体サブユニットの発現についてドレブリンノックアウト動物を用いた検証、②生化学的手法による各サブユニットの発現量検証、③超解像顕微鏡によるタンパク質局在解析手法の改善、④ヒトiPS細胞由来神経細胞の培養法の確立、を行ってきた。①については、ドレブリンはE型アイソフォームとA型アイソフォームがあるが、A型アイソフォーム特異的ノックアウト動物（DAKO）と、E型・A型両アイソフォームノックアウト動物（DXKO）を通常個体（WT）と比較することにより、NMDAR各サブユニットとドレブリンE型・A型アイソフォームとの相互関係を概観してきた。具体的には、各マウス（WT、DAKO、DXKO）から調整した初代培養神経細胞を用いて経時的に各サブユニットの発現数を計測した。②は各動物から脳を摘出し、ウェスタンブロッティング法により各サブユニットの発現量を定量した。③については、超解像顕微鏡による局在解析を行うために、まずは細胞の培養条件を検討し、適切なチャンバーを選定した。さらに色素等も検討し、ダイレクトラベリングも行えるようになっている。既にいくつかのシナプスタンパク質、ドレブリンやシナプシンI、PSD-95などの局在解析が進んでいる。④は、いくつかのヒトiPS細胞由来神経細胞を用いて培養を試み、その方法を検討中である。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後は超解像顕微鏡による各サブユニット局在の詳細検討、並びに足場タンパク質の関与について検証を行っていく。また、ヒトiPS細胞由来神経細胞についても同様の解析を検討していく。
|
| Causes of Carryover |
超解像顕微鏡を用いた解析において、条件検討に少し時間を費やす結果となった。加えて、超解像顕微鏡解析ではデータサイズが大きいため、画像取得・ならびに画像解析に時間がかかる。そのため、当初予定していたほど抗体等の消費が進まなかった。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
超解像顕微鏡を使用する際の条件がほぼ確定したので、今後は超解像顕微鏡の解析が中心となっていく。そのため抗体や封入剤等の消費が前年度よりは多くなることが見込まれるので、その分に充てていく。
|
Research Products
(6 results)
