2016 Fiscal Year Research-status Report
中心体型BRCA1複合体: 治療標的としての新規BRCA1複合体のがん抑制機構
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16K18409
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
吉野 優樹 東北大学, 加齢医学研究所, 助教 (60755700)
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2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | BRCA1 / 乳がん / 中心体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
新規BRCA1結合分子BIP2によるBRCA1の中心体局在の制御機構を解析するため、BIP2を過剰発現し、中心体のBRCA1局在量を評価した。その結果、BIP2の過剰発現はG2期の細胞で特異的にBRCA1の中心体局在を増強させた。一方、BIP2との相互作用が減弱するBRCA1変異体を細胞に発現させたところ、野生型BRCA1と比較して変異型BRCA1の中心体局在は弱かった。従って、BRCA1はRACK1との相互作用に依存的に中心体に局在する事が示唆された。
中心体制御におけるBRCA1とRACK1の相互作用の重要性を解析するため、BRCA1欠損細胞にBIP2およびBRCA1を発現させ、中心体数の異常を観察した。その結果、BRCA1欠損細胞にBIP2を単独で発現させた場合に比較して、BRCA1を共発現させた場合にはより高度の中心体増幅を認め、BIP2はBRCA1に依存的に中心体増幅を引き起こすと考えられた。
野生型BRCA1を有するがん細胞および正常乳腺上皮細胞を用いて同様の解析を行うと、BIP2を単独で過剰発現させると中心体増幅を認めるが、BRCA1とBIP2を共発現した場合には中心体増幅が認められなかった。一方、BIP2との相互作用が減弱するBRCA1変異体を共発現させた場合、中心体増幅を認めたことから、これらの野生型BRCA1を有する細胞においてはBRCA1はBIP2との相互作用に依存的に中心体増幅を抑制する事が疑われた。
さらにBIP2の発がんへの関与を解析するため、COSMICデータベースに登録されたBIP2変異から11変異を選択し、変異体発現ベクターを作製した。これらを過剰発現させたところ、C末端側の6変異体を含む7変異体で中心体増幅を認めず、これらの変異によってBIP2の中心体制御能に異常が生じる事が明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定していた通り、BIP2の過剰発現による中心体のBRCA1局在の変化や中心体制御活性を評価できている。BIP2の発現抑制時の解析が、siRNAを用いたBIP2の発現抑制では抑制効率が低く、解析ができなかったが、代替法としてオーキシン誘導性タンパク質分解系を用いることとし、必要な細胞株を樹立できたため、これを用いて解析を進める予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
BIP2の過剰発現時の中心体数およびBRCA1の中心体局在の解析は終了したため、次に作製したオーキシン誘導性タンパク質分解系を用いたBIP2欠損細胞を用い、BIP2欠損状態における中心体制御系の異常、およびBRCA1の中心体局在の変化を観察する予定である。また、BIP2依存性のBRCA1の中心体への輸送の分子機構を解明するため、分子モーターであるダイニンやキネシンの阻害薬を用いてBRCA1の中心体局在の変化を調べる。
現在までにBRCA1、BIP2はいずれも中心体に局在することは明らかになっているが、中心体内での微小局在部位は明らかになっていない。BRCA1およびBIP2の中心体内の微小局在を3D-SIMを用いて明らかにし、BIP2過剰発現および欠損状態におけるBRCA1の局在の変化を、微小局在レベルで解析する予定である。
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| Causes of Carryover |
主として、siRNAを用いたノックダウン効率が悪く、別の系を用いることになったため、siRNA合成費用およびトランスフェクション試薬の購入費用が不要となったためである。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
オーキシン誘導性タンパク質分解系の樹立とその効果確認のための試薬が追加で必要である。また、3D-SIMを用いたBRCA1、BIP2の中心体内の微小局在の観察のため、多重染色用の蛍光標識抗体の購入、および所属施設の共通機器室に支払う3D-SIM使用料金として用いる予定である。
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Research Products
(4 results)
