2017 Fiscal Year Research-status Report

前立腺がんにおけるアンドロゲン応答性マイクロＲＮＡのエピゲノム作用機構の解明

Research Project

Project/Area Number	16K18411
Research Institution	Nippon Medical School
Principal Investigator	三沢彩日本医科大学, 医学部, 助教 (20598453)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	lncRNA / ALPL / HOTAIR / エピジェネティクス / 石灰化 / 前立腺がん
Outline of Annual Research Achievements	平成29年度まで、骨芽細胞様骨肉腫細胞株 SaOS-2 における長鎖非コードRNA (long non-coding RNA, lncRNA) HOTAIR の発現及び機能解析を行い、骨芽細胞の石灰化において HOTAIR が Tissue Non-Specific Alkaline Phosphatase 遺伝子(ALPL) の発現をエピジェネティックに制御していることを明らかにした。 SaOS-2 細胞の石灰化誘導において HOTAIR が関与するか調べるため、HOTAIR をターゲットとした siRNA を細胞にトランスフェクションして Mineralization Assay 及び Alkaline Phosphatase Assay を行った。その結果、HOTAIR の抑制による石灰化の亢進、及びアルカリフォスファターゼ活性の上昇が認められた。定量的 RT-PCR 法により、石灰化を誘導した SaOS-2 細胞において HOTAIR の抑制による ALPL の発現誘導が認められ、 HOTAIR は ALPL を介して石灰化を負に制御していることが示唆された。 HOTAIR が ALPL の発現を抑制するメカニズムを明らかにするため、ALPL のプロモーターでドライブされる Luciferase ベクターを用いて Reporter Gene Assay を行った。SaOS-2 細胞に siHOTAIR、またはコントロールの siNC をレポーターベクターとコトランスフェクションして石灰化を誘導した結果、siHOTAIR による Luciferase 活性の上昇が認められた。この結果より、HOTAIR が ALPL のプロモーターに作用することによって遺伝子の発現を抑制していることが示唆された。 HOTAIR による ALPL の制御がエピジェネティックな機構によって行われているか、ALPL のプロモーター領域のヒストンのメチル化状態を ChIPアッセイ法で調べた。siRNA で HOTAIR を抑制した細胞ではコントロール細胞と比較して、ALPL のプロモーター領域のヒストン H3K4 ジメチル化及びトリメチル化が上昇した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason これまでの研究より、SaOS-2 細胞の石灰化においてHOTAIR がヒストンのメチル化を介したエピジェネティックな機構により ALPL の発現を抑制していることが示唆された。前立腺がんは進行すると骨に転移しやすいことが知られており、アンドロゲン応答性非コードRNA である HOTAIR は前立腺がんの転移に関わることが報告されてきた。一方、骨の石灰化において中心的な役割を果たすALPL は転移性前立腺がんの増殖に関与し、患者の無病生存率に関与することが報告されている。本研究では前立腺がんと石灰化の関連性を調べ、HOTAIR が ALPL の発現をエピジェネティックに制御することによって骨の石灰化のみならず、前立腺がんの骨転移にも関与しているという仮説を立た。骨転移した前立腺がんより樹立された VCaP 細胞株は ALPL を発現していることが報告されている。そこで、VCaP 細胞を用いて SaOS-2 と同様に Mineralization Assay を行った。細胞を播種してほぼコンフルエントな状態で石灰化誘導培地に置換し、その後1週間程度で石灰化が認められた。前立腺がん細胞は転移巣である骨に到達すると骨特有の性質を示すことが示唆され、骨転移のメカニズム、及び骨での前立腺がん細胞の増殖に関する手がかりを得ることができた。
Strategy for Future Research Activity	今後は骨芽細胞様骨肉腫細胞株以外に前立腺がん細胞株を用いて研究を広げ、がんの骨転移に焦点を当てて研究を進めていく方針である。HOTAIR に関連する lncRNA が転移に関わっていることがいくつかのがん種で報告されている。そのメカニズムとして、標的遺伝子のプロモーターにおけるヒストンのメチル化などが関わっていることが示唆され、HOTAIR と類似した機能を示すことが明らかになった。そこで、前立腺がんにおいてもこれらの lncRNA が転移に関わっているか、また、がん細胞骨での増殖においてどのような役割を担っているか、これまでの実験結果と関連付けながら明らかにしていく。既にこれらの lncRNA をknockdown する siRNA を用いて実験を行っており、上流因子を調べると共に、下流因子を探索してパスウエイ解析につなげる予定である。
Causes of Carryover	平成２８年６月１日から９月３０日までの期間、出産・育児のため研究が中断されていた。また、計画当初はアンドロゲン応答性 lncRNA を新規に同定するため RNA シークエンスが予定されていたが、実験を進めるにつれて既知の lncRNA HOTAIR が骨の石灰化と前立腺がんの骨転移を結びつける重要な因子である可能性が示唆され、HOTAIR による ALPL の発現制御機構を詳細に調べることとした。更に公開データベースより、骨転移した前立腺がんより樹立された VCaP 細胞株で HOTAIR に関連した lncRNA の発現が高いことを見出し、RNA シークエンスを行う必要がなくなった。