2016 Fiscal Year Research-status Report
PAR化修飾によるクロマチン高次構造制御・遺伝子転写調節機構の包括的解析
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16K18469
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
藤木 克則 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 助教 (10646730)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | PAR化 / クロマチン高次構造 / 転写調節 / １細胞解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的はクロマチン上のタンパク質ポリADPリボシル化修飾がクロマチン高次構造にどのような影響を与えるのかを、次世代シーケンサーを用いた新たな解析手法を開発することによって明らかにすることである。当初の計画では、細胞中のクロマチン高次構造を既存のChIA-PETやMNase-seq等の手法を用いて解析することを目標としていたが、昨今の当該分野の研究の潮流や他グループの類似研究の動向から判断して、１細胞の解像度でこれら高次構造を明らかにできる新手法を開発することが望ましいと判断された。そこで本年度においては１細胞におけるMNase-seq法の開発を行った。この方法ではマイクロ流体チップを利用して細胞を微小液滴内に封入しMNaseによりモノヌクレオソーム化したのち、細胞特異的なアダプター配列によってヌクレオソームをラベルし、配列を解読してヌクレオソームの位置をゲノム上にマッピングする。マイクロ流体チップの開発においては早稲田大学理工学術院竹山春子研究室の細川正人助教の協力のもと、3inlet-1outletチップを作成し液滴封入条件の検討を行なった。また細胞特異的なアダプターを付着させたオリゴビーズを新たに開発し、マイクロ流体チップを用いて細胞とともに効率的に液滴内に封入することに成功した。さらに、液滴内におけるクロマチンのモノヌクレオソーム化に成功しその最適条件を決定した。これらはいずれも１細胞MNase-seq実験の基礎技術となるものである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
28年度の目標は、PAR化によるクロマチン高次構造をゲノムワイドに解析するための次世代シーケンサーを用いた新手法の開発におけるwetな実験部分の実験手法の新規開発と実験条件の最適化であった。そこでまず１細胞MNase-seq法の実現に必要となる各材料の開発を行い、高効率なクロマチンの回収に必要なビオチン化ヒストンH3を発現する細胞株の作成、液滴中で細胞特異的なアダプターを提供するオリゴビーズの開発、これらを液滴に封入する3inlet-1outletのマイクロ流体チップの開発と液滴作成システムの構築を行なった。さらにこれらを用いて、１細胞分の染色体を結合したストレプトアビジンビーズ“１細胞ビーズ”の作成、ビーズ上でのMNaseによるクロマチンのモノヌクレオソーム化、マイクロ流体チップを用いたオリゴビーズ・１細胞ビーズの１：１比率での微小液滴への封入、液滴内でのアダプターの接合の条件をそれぞれ最適化した。当初の目標は28年度中でのシーケンスライブラリ作製であったが、そのために必要なここの実験条件はほぼ全て出揃っているため、２９年度の早い段階で目標を達成できると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
クロマチン高次構造解析技術のwet部分の開発はほぼ予定通り進んでいる。２９年度においてはまず早い段階でこの１細胞MNase-seqのwet部分の各実験を統合し次世代シーケンサー解析用のライブラリの作成を行う。これを次世代シーケンサーによって配列解読し、出てきたデータをゲノム上にマッピングするためのソフトウェアの開発に着手する。また、出てきたデータのクォリティーをチェックし、１細胞あたりのリード数を上げるための実験系のブラッシュアップを行う。２９年度中に実験系を確立し、１細胞MNase-seq実験のルーチンな運用ができることを目標とする。
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Research Products
(6 results)
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[Journal Article] ARCN1 Mutations Cause a Recognizable Craniofacial Syndrome Due to COPI-Mediated Transport Defects.2016
Author(s)
Izumi K, Brett M, Nishi E, Drunat S, Tan ES, Fujiki K, Lebon S, Cham B, Masuda K, Arakawa M, Jacquinet A, Yamazumi Y, Chen ST, Verloes A, Okada Y, Katou Y, Nakamura T, Akiyama T, Gressens P, Foo R, Passemard S, Tan EC, El Ghouzzi V, Shirahige K.
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Journal Title
The American Journal of Human Genetics
Volume: 4
Pages: 451-9
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
