2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development of screening method using large deletion in Marchantia polymorpha
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16K18472
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Research Institution | Ritsumeikan University |
Principal Investigator |
菅野 茂夫 立命館大学, 立命館グローバル・イノベーション研究機構, 助教 (60726313)
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Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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Keywords | ゲノム編集 / ゼニゴケ / 性染色体 / in silico デザイン / gRNA活性 |
Outline of Annual Research Achievements |
ゼニゴケの性染色体遺伝子を破壊するために,gRNAの設計ソフトの改良を行った.具体的には,オフターゲット探索を高速に処理できるようbowtieを組み込んだ.加えて,pythonを利用して,ゼニゴケゲノムDNA情報(JGI3.1)とアノテーションファイル(GFF3)から,(1)ゼニゴケの遺伝子のCDSの中心部にオフターゲットの少ないgRNAを6本設計する.(2)ゼニゴケの遺伝子のcoding領域の両端にgRNAを設計する.という機能を持ったソフトウェアを作成した.性染色体の遺伝子だけではなく,全遺伝子に対してgRNAを設計し,ゼニゴケ国際ミーティングで発表した(65th NIBB conference).X染色体に関しては,遺伝子間領域に関してもBLAST検索を行い,JGIのアノテーションには含まれない複数の遺伝子候補を同定した.ゲノム編集ベクターにおいては複数のgRNAを同時に発現させることで,large deletionがどの程度の頻度で生じるのか確認した.形質転換株の20%ほどで4.5 kbの欠失を安定に生じさせる系を作製した.本実験と,既に証明した高効率ゲノム編集ベクターに関して,論文を執筆し,プレプリントサーバーbioRxivにて公開した(https://doi.org/10.1101/277350).さらに,large deletionを起こすためのベクターをaddgeneにデポジットした.現在,384プレートフォーマットでオリゴを作製し,並列でコンストラクションを進めている.これらのベクターをゼニゴケに形質転換しスクリーニングを行う予定であったが,異動に伴い形質転換系がうまく動作しなくなったため,スクリーニングには至っていない.形質転換効率を上げるために新しくアガートラップ法を利用して形質転換系を立ち上げた.
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Research Products
(3 results)