2016 Fiscal Year Research-status Report
piRNA生合成に関わる細胞質構造体Yb body及びFlam bodyの解析
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16K18488
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
室田 友紀子 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 特任研究員 (30774707)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | piRNA生合成 / PIWIタンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
piRNAは、生殖組織特異的に発現する小分子RNAで、PIWIタンパク質と結合してRISCを形成し、トランスポゾン等の遺伝子発現を抑制している。生殖組織におけるトランスポゾンの転移はゲノムの損傷を引き起こし、卵・精子形成不全や不稔を導く。piRNAは、一次経路と二次経路により産生される。本研究において使用したショウジョウバエ卵巣由来体細胞株OSCは、PIWIタンパク質の一つであるPiwiが関与する一次経路のみが発現している。OSCにおける一次経路では、Ybというタンパク質が中核となる細胞質顆粒体Yb bodyがpiRNAの生合成の場であることが分かっており、Yb bodyには、ArmiやVret、SoYbといったタンパク質が局在することが報告されている。しかし、VretやSoYb等の個々のタンパク質の詳細な機能は明らかとなっていない。
当研究室において作成した抗Vretモノクローナル抗体を用いて免疫沈降を行うと、YbやArmi、Piwi、SoYbといった、既知のYb body構成因子が同定される。その為、Vretに着目し、Yb body構成因子同士の相互作用解析を行なった。まず抗Vret抗体を用いた免疫沈降を行なう際に、RNaseを処理することにより、前述のタンパク質間相互作用がRNAを介しているかどうかを確認した。その結果、VretとSoYbは、タンパク質同士で相互作用をしており、VretとArmiやYbはRNAを介していることが確認された。また、Vretをノックダウンした細胞において、SoYbが不安定化し、SoYbをノックダウンした細胞において、Vretが不安定化することも分かった。この結果により、SoYbとVretはお互いの安定性を高めることで、協調して機能していることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当研究室において作成した抗Vretモノクローナル抗体を用いて免疫沈降を行うと、既知のYb body構成因子が同定されることが明らかとなっていた為、Vretに着目してYb body構成因子同士の相互作用を調べた。RNaseを用いた免疫沈降の結果、VretとSoYbは、タンパク質同士で相互作用をしている一方、VretとArmiやYbはRNAを介していることが分かった。また、VretやSoYbのノックダウン実験により、この2つのタンパク質は相互にタンパク質の安定化をしあっていることも明らかとなった。今後、VretとSoYbの更なる機能を解析することにより、本研究の目的であるpiRNAの生合成経路の解明に近づけると考える。しかし、もう一つの細胞質顆粒体であるFlam bodyの構成因子の探索については未だ不明なままである。その為、おおむね順調に進展していると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の研究により、Yb bodyの構成因子であるVretとSoYbがお互いに安定化しあいながら協調して働いていることが明らかとなった。そのため、この２つの因子のさらなる機能を明らかにしていくことで、一次経路における新たな知見を得ることができると考えられる。VretとSoYbはともにTudor domainを持つことが分かっている。VretとSoYbの結合部位の解析やそれぞれのタンパク質に結合する新規結合因子を探すことにより、さらなる機能を明らかにすると考えられる。また、SoYbについては、Tudor domainに加えて、Helicase domainを有している。そのため、SoYbは何らかのRNAと結合していると考えられる。そこで、当研究室で作成した抗SoYbモノクローナル抗体を用いたCLIPを行い、SoYbに結合している、RNAを明らかにしていく。
さらに、Flam body構成因子の探索も行う。piRNA 生成に必須なヌクレアーゼである Zuc をノックダウンした条件下では、Yb bodyとFlam bodyが重なる。この条件下では、Flam body構成因子とYb body構成因子の相互作用 が凍結されている可能性が考えられる。そこで、Zuc をノックダウンした状態で、抗Vret抗体を用いて免疫沈降を行なうことにより、Yb bodyの構成因子と共に Flam body構成因子を精製することを試みる。得られた新規タンパク質は質量分析に供し、同定する。
Yb bodyとFlam bodyの構成因子を明らかにすることで、piRNA前駆体からどの様に成熟型piRNAが産生されるかを理解することを目標とする。
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