2017 Fiscal Year Annual Research Report
Molecular mechanism elucidation of multifunctional tRNA ligase in tRNA splicing
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16K18498
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
加藤 公児 北海道大学, 先端生命科学研究院, 助教 (30452428)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | tRNスプライシング / X線結晶構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
tRNAのスプライシングはmRNAの自己スプライシングとは異なり、複数のタンパク質性酵素によって触媒される。近年、研究代表者らは多機能性tRNAリガーゼ（Trl1）のリガーゼドメイン（Trl1-LD）の構造を決定し、これまでに提唱されていたライゲーション反応が活性化中間体を経るという仮説を、初めて構造から証明した。本研究では、Trl1-tRNA複合体のX線結晶構造解析を行い、構造をもとにtRNAスプライシングにおける3段階のライゲーション反応の分子機構を解明することを目的とする。
平成29年度はTrl1-tRNA複合体の構造解析に向けて、Trl1-tRNA複合体の大量調整し、結晶化を試みた。前年度の相互作用解析の結果、Trl1全長とTrl1-LDのみtRNAエキソンと安定な複合体を形成することが確認されたため、精製したTrl1全長、及びTrl1-LDとin vitroで転写したtRNAエキソンを混合しゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、それぞれの複合体を高純度で大量に調整した。それらのサンプルを用いて、それぞれについて約2000条件で結晶化スクリーニングを行ったが、結晶は得られなかった。そこで既に構造が得られているTrl1-LD結晶を用いて、10mMの濃度の核酸を浸漬（ソーキング）させることによってTrl1-LDと核酸の複合体の構造解析を試みた。その結果、2.75オングストローム分解能で構造解析可能なX線回折強度データを収集することに成功し、構造を決定することができた。その構造にはTrl1-LDの活性中心付近に２分子の核酸（GMP）が結合しており、そのGMPと相互作用しているアミノ酸、及びその周辺には塩基性のアミノ酸が集中していたことから、これらのGMPはライゲーション過程のtRNAエキソンをミミックしているものと考えられた。
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Research Products
(2 results)
