溶液NMRを用いたフロリゲン複合体の立体構造解析

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K18505
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 古板 恭子 大阪大学, たんぱく質研究所, 特任研究員 (30727665)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 溶液NMR / 立体構造 / タンパク質 / フロリゲン

Outline of Annual Research Achievements

フロリゲンは花成を誘導する植物ホルモンとして同定されたタンパク質である。フロリゲンは受容体14-3-3及び転写因子FDとともにフロリゲン活性化複合体（FAC）を形成し、花芽形成遺伝子を発現させて花成を誘導する。近年、フロリゲンはFD以外の転写因子とFAC様複合体を形成することで、花成以外にも様々な光周性の反応を制御することが明らかになりつつある。本研究では、FACを形成するタンパク質の構造特性を明らかにし、フロリゲンの機能多様性への理解を深めるために、溶液NMR法を用いた高分子量タンパク質解析法を開発するとともに、分子量およそ11万のFACの立体構造解析を目指している。
平成29年度には、FAC構成因子のうち、分子量およそ5.5万の14-3-3の解析を進めた。まず、平成28年度に実施した14-3-3の主鎖の帰属をさらに進めるために、アミノ酸選択的13C,15N標識の利用を試みた。アミノ酸選択的15N標識は、アミノ酸の種類によっては選択性が低いという問題があるが、13Cは高い選択性でアミノ酸選択的標識をすることができる。そこで、アミノ酸選択的13C,15N標識サンプルを用い、13Cで編集することでアミノ酸選択的1H-15N相関スペクトルを得る測定法を開発した。この測定法は高分子量タンパク質であっても比較的感度が良く、実際に4種のアミノ酸について14-3-3の1H-15N相関スペクトルを得ることができた。得られたスペクトルを参照して主鎖の帰属を進めたところ、80.1%の主鎖帰属を達成することができた。また、側鎖の帰属をするため、cell-freeでアミノ酸選択的13C,15N標識サンプルを調製し、HSQC、HCCH-TOCSY、13C-NOESYスペクトルの測定を行った。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成28年12月から平成29年11月まで、出産・育児のために研究を中断したために、予定よりも研究が遅れている。

Strategy for Future Research Activity

14-3-3の側鎖帰属のために測定したスペクトルは、ある程度の信号は得られたものの、構造決定には不十分であった。今後、標識法や測定法を検討し、側鎖の解析を進める。また、高分子量タンパク質の解析法を開発し、それを14-3-3に適用し、立体構造解析を進める。FACの他の構成因子についても構造解析を進める。さらに、FACが安定に存在する条件を検討し、FACの構造情報の取得を試みる。

Causes of Carryover

出産育児のために約1年間研究を中断していたため、次年度使用額が生じた。
助成金は主にサンプル調製のための消耗品に当てる。また、学会参加および研究打ち合わせのための旅費に当てる。