2017 Fiscal Year Research-status Report
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16K18511
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
中村 彰良 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究員 (10583891)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | X線結晶構造解析 / tRNA修飾 / アミノアシルtRNA合成酵素 / DNA/RNAポリメラーゼ / 鋳型依存伸長反応 / タンパク質 / 核酸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、通常の核酸合成酵素とは逆向きの3′-5′方向への塩基伸長活性を有する酵素Thg1とTLPが発見され，遺伝情報伝達機構の新事実に注目が集まっている．研究代表者らはこれまでにThg1とTLPのtRNA複合体構造の解析に成功し，新規のRNA認識機構を提唱してきている．本研究では，未解明であるTLPのアンチコドン認識様式をX線結晶構造解析およびX線小角散乱解析によって明らかにし，提唱したRNA認識機構の全容を解明する．また得られた知見を元に，tRNAのみならず多様なRNAに対し3′-5′方向への塩基伸長を可能とする手法を確立し，全く新しい研究ツールへの応用に繋げることも目的としている．
昨年度はThg1およびTLPが有する3′-5′方向の塩基伸長活性を１本鎖RNAへ展開するために、tRNAを鋳型RNAと基質RNAに分割した2本鎖RNA (分割型tRNA)を作成し，Thg1の塩基伸長活性を1本鎖RNAに適用することに成功した。今年度はThg1の活性を指標としたin vitro selection法を構築し，Thg1の基質となりうるtRNAとは全く異なる2次構造を有するRNAの探索に成功した。その後、得られた新規RNAの機能解析を行い、ゲルろ過分析によってThg1との相互作用を確認した。また、生化学実験から塩基認識機構はtRNAと共通であることを明らかにした。
TLPのRNA認識機構の解明に関しては、昨年度に引き続きTLP-tRNAHis複合体を大量調製し、TLP-tRNAHis複合体の結晶化条件の探索に加え複合体の調製方法も検討したが、現在までに良質な結晶は得られていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度はThg1およびTLPの利活用に向け、tRNA以外の基質RNAの探索を行い，tRNAの2次構造とは全く異なる新規RNAの発見に成功した。しかし、TLP-tRNAHis複合体のX線結晶構造解析に関しては良質な結晶が得られていないため、来年度は結晶化条件の最適化に努める。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続きTLP-tRNAHis複合体の結晶化条件の最適化に取り組み，良質な結晶を得るよう努める．Thg1およびTLPの応用に関しては、分割型tRNA、また発見した新規RNAが塩基認識の解析に有用であることが分かったので、蛍光基等を有する修飾塩基に対する活性の評価を行う。さらに、分断型RNAの相補鎖領域の配列を変えることで、多様な配列を有する1本鎖RNAへの応用を検討する。
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| Causes of Carryover |
TLP-tRNAHis複合体の良質な結晶が得られなかったため、回折データ測定に必要な出張費およびX線結晶構造解析に必要な消耗品、設備費の使用がなく、予定よりも使用金額が下回った。
TLP-tRNAHis複合体の結晶化条件の探索のために必要な結晶化スクリーニングキットの購入に使用する。また、学会参加費や英文校正料，研究成果論文投稿料に充てる。
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