2017 Fiscal Year Annual Research Report
Establishment of anti-ghrelin receptor antibodies for crystallization
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16K18515
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
椎村 祐樹 京都大学, 医学研究科, 客員研究員 (40551297)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | グレリン受容体 / 立体構造認識抗体 / GPCR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、グレリン受容体のX線結晶構造解析に資するグレリン受容体立体構造認識抗体を取得することを目的としている。平成29年度は、前年度に作出した23株の抗グレリン受容体抗体産生細胞株の①モノクローン化および②抗体の大量発現と精製を行い、③抗体がグレリン受容体の安定化に寄与するか検討した。さらに④熱安定性に寄与した抗体のシークエンス解析を行った。①23株の抗体産生細胞株のモノクローン化を行った。細胞を96ウェルに限界希釈することでシングルコロニーを得た。これらのシングルコロニーが、目的とする抗グレリン受容体抗体を産生しているか、ELISA法によって確認した。その結果、23株のうち10株の抗体産生細胞株のモノクローン化に成功した。②抗体の大量発現と精製を行った。抗体産生細胞株を135 mLで培養し、Protein Aカラムを用いて、IgG精製した。精製したIgGは、パパイン処理することによって断片化した。その後、ゲル濾過クロマトグラフィーによってFab断片とFc断片を分離した。③精製した抗体Fab断片がグレリン受容体の安定性に寄与するか検討した。グレリン受容体を精製し、作出した抗体Fab断片と混和して複合体形成させた。その後、CPM assayによって熱安定性を測定した。その結果、10株の抗体株のうち、2種類がグレリン受容体の熱安定性を3度程度向上させた。④熱安定性に寄与した2株の抗体のシークエンス解析を行った。細胞株からRNAを抽出して逆転写反応によってcDNAを作製した。このcDNAを用いて、抗体のL鎖およびH鎖特異的なプライマーでPCRを行い、サブクローニング後、シークエンス解析を行った。その結果、これら2株は、同一クローンであることを確認した。
本研究によって、グレリン受容体のX線結晶構造解析に資するグレリン受容体立体構造認識抗体を1株取得することができた。
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