2016 Fiscal Year Research-status Report
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16K18517
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| Research Institution | Tokyo Women's Medical University |
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Principal Investigator |
出嶋 克史 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (60457439)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | C. elegans / systemic RNAi |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、dsRNAやmicroRNAなどの機能性RNAが細胞間を伝播し細胞非自律的に遺伝子の発現調節を担うことが知られるようになり、新しい細胞間情報伝達機構として注目されている。しかし、細胞外の機能性RNAが伝播する分子機序について十分な理解はなされていない。本研究では、線虫における細胞非自律的なRNAi（全身性RNAi）という現象に着目し、細胞外dsRNAの取り込みと放出過程における小胞輸送経路の分子実体と役割を明らかにし、細胞がdsRNAを取り込む分子機序を解明することを目的としている。全身性RNAiに関与する新規因子を同定するために、線虫C. elegansを用いて順遺伝学的なサプレッサースクリーニングを行い、全身性RNAiが効きにくい変異体(rsd変異体)における全身性RNAiの不全を抑圧する遺伝子変異体を取得し、遺伝子マッピングやトランスジェニックレスキュー実験を行う事で、そのうちの一つの原因遺伝子を同定した。同定した遺伝子は金属イオンを輸送すると考えられる溶質輸送体であり、本輸送体の機能解析を中心に行い、本輸送体が細胞非自律的に機能する事を示唆する知見などを得た。機能性RNAの伝播に関わる新規因子として溶質輸送体を同定し、本輸送体を介した小胞輸送がdsRNAの伝播に関わる事を、The 7th Asia-Pacific Worm meetingにて発表した。現在、論文として発表する準備を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
同定した遺伝子がどこで機能するかという点を明らかにするべく、プロモーターにGFPを挿入したDNAを線虫に導入し、遺伝子発現様式を調べた（発現解析）。その結果、本分子が全身で広く発現することを見出した。また、本分子がdsRNAの取り込み細胞で必要か否かを組織特異的プロモーターを用いた遺伝子レスキュー実験やモザイク解析を行いて検証した（細胞自律性の検証）。一連の実験から、本分子が細胞非自律的に機能することを示唆するデータを得た。また、蛍光タンパク質を付けたコンストラクトを発現させ、厳密な細胞内局在も調べた（細胞内局在解析）。その結果、本分子は主に後期エンドソームに局在することが明らかとなった。加えて、変異体や過剰発現株における亜鉛濃度を亜鉛特異的蛍光プローブを用いて調べ、先行論文に準じて輸送体としての機能を評価したところ、本分子の機能喪失株では、細胞内亜鉛レベルが低下している可能性を支持する結果を得た。本分子と細胞内亜鉛レベルの関係性について、現在、別のレポーターを作成して条件検討及び解析を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
亜鉛輸送全般がdsRNAの伝播に関わる可能性を検証すべく、一連の亜鉛輸送体の遺伝子破壊株の解析を行う。10遺伝子については遺伝子破壊株を作成する必要があるので、それらの作成をCRISPR-Cas9システム（Friedland AE et al., Nat. Methods 2013）によって行う。他方、本輸送体が小胞輸送のどの過程に関与するかという点を、変異体における各種オルガネラマーカーの細胞内局在を解析することで検討する。亜鉛要求性の小胞輸送分子としてはFYVEドメインを有するタンパク質を想定する: FYVEドメインはリン脂質のPI(3)Pと結合するが、その結合には亜鉛イオンを必要とする。FYVEドメイン保有タンパク質の殆どは小胞輸送に関わると考えられるが、これまでに、dsRNAの伝搬にFYVEドメインを保有する分子が関与するといった報告は無い。EpsinRが別のタイプのリン脂質PI(4)Pに結合する活性を有している事を踏まえても、FYVEドメインを有するタンパク分子の機能が亜鉛イオンの濃度によって調整されている可能性が高い。そこで、線虫のFYVEドメイン保有タンパク質（15種）の機能破壊株がEpsinR変異体の全身性RNAi異常を抑圧するかという点を指標に実働分子の探索を行う。15遺伝子のうち12遺伝子については既に遺伝子破壊株が利用可能である。残りの3遺伝子についてはCRISPR-Cas9システムによって遺伝子破壊を行う。致死となる変異体については光遺伝学を利用したタンパク質機能破壊（chromophore-assisted light inactivation）を用いて機能阻害を行う（Bulina et al., Nat. Biotechnol. 2006）。
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| Causes of Carryover |
消耗品として、遺伝子工学（ポリメラーゼ、制限酵素、プレップ、シークエンス等）やイメージングに要する試薬を中心に、プラスティック器具として主にスライドグラス、線虫培養用シャーレ、チューブ類を購入する予定であったが、一部の解析が計画通りに進まなかったため、次年度使用額分の未使用金が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
効率的に研究を進め、当該年度に計画していた実験を次年度に行い、消耗品として、遺伝子工学（ポリメラーゼ、制限酵素、プレップ、シークエンス等）やイメージングに要する試薬を中心に、プラスティック器具として主にスライドグラス、線虫培養用シャーレ、チューブ類を購入する予定である。
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Research Products
(4 results)
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[Journal Article] Chondroitin 4-O-Sulfotransferase Is Indispensable for Sulfation of Chondroitin and Plays an Important Role in Maintaining Normal Life Span and Oxidative Stress Responses in Nematodes2016
Author(s)
Izumikawa T, Dejima K, Watamoto Y, Nomura KH, Kanaki N, Rikitake M, Tou M, Murata D, Yanagita E, Kano A, Mitani S, Nomura K, Kitagawa H.
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Journal Title
J. Biol. Chem.
Volume: 291
Pages: 23294-23304
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Genetic engineering of chromosomal balancer toolkit for gene-clusters mediated by CRISPR/Cas9 in Caenorhabditis elegans.2016
Author(s)
Iwata, S., Dejima, K., Hori, S., Yoshina, S., Suehiro, Y., Mitani, S
Organizer
The 7th Asia-Pacific Worm meeting
Place of Presentation
中国、北京
Year and Date
2016-06-26
Int'l Joint Research
