2017 Fiscal Year Research-status Report
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16K18517
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| Research Institution | Tokyo Women's Medical University |
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Principal Investigator |
出嶋 克史 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (60457439)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | C. elegans / Systemic RNAi |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、二本鎖RNAやマイクロRNAなどの機能性RNAが細胞間を伝播し細胞非自律的に遺伝子の発現調節を担うことが知られるようになり、新しい細胞間情報伝達様式の一つとして注目されている。例えば、血中RNAの種類は癌など、疾患に伴って変化することが知られており、配列特異的な疾患マーカーや核酸医薬として、診断や治療戦略に新たな選択肢を提供する可能性が高い。しかし、細胞外に存在する機能性RNAが細胞間を移動する分子機序について十分な理解はなされていない。
本研究では、線虫Caenorhabditis elegans (C. elegans) における細胞非自律的なRNAi（全身性RNAi）という現象に着目し、細胞外dsRNAの取り込みと放出過程における小胞輸送経路の分子実体と役割を明らかにし、細胞がdsRNAを取り込む分子機序を解明することを目的としている。
全身性RNAiに関与する新規因子を同定するために、C. elegansを用いて順遺伝学的なサプレッサースクリーニングを行い、全身性RNAiが効きにくい変異体(rsd変異体)における全身性RNAiの部分的な不全を抑圧する遺伝子変異体を取得し、遺伝子マッピングやトランスジェニックレスキュー実験を行う事で、そのうちの一つの原因遺伝子を同定した。同定した遺伝子は亜鉛を輸送すると考えられる溶質輸送体（Solute carrier family）であり、本輸送体の機能解析を中心に行い、本輸送体が細胞非自律的に機能する事を示唆する知見などを得た。加えて、本輸送体の細胞内局在を明らかにしている。また、関連する遺伝子の遺伝子破壊株を作成、利用することで、各種変異体株における全身性RNAiの効率を調査しその分子機構を調べている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
同定した遺伝子がどこで機能するかという点を明らかにするべく、プロモーターにGFPを挿入したDNAを線虫に導入し、遺伝子発現様式を調べた（発現解析）。その結果、本分子が全身で広く発現することを見出した。また、本分子がdsRNAの取り込み細胞で必要か否かを組織特異的プロモーターを用いた遺伝子レスキュー実験やモザイク解析を行って検証した（細胞自律性の検証）。一連の実験から、本分子が細胞非自律的に機能することを示唆するデータを得た。また、蛍光タンパク質を付けたコンストラクトを発現させ、厳密な細胞内局在も調べた（細胞内局在解析）。その結果、本分子は主に後期エンドソームに局在することが明らかとなった。加えて、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を利用することで細胞質中の亜鉛レベルを線虫の生体内で測定する実験系を構築した。この系を用いて輸送体としての機能を評価したところ、本分子の機能喪失株では細胞内亜鉛レベルが低下している可能性を支持する結果を得た。また、CRISPR-Cas9システム（Friedland AE et al., Nat. Methods 2013）によって関連する遺伝子のノックアウトを行い、各種変異体株における全身性RNAiの効率を調査しその分子機構を調べている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度は亜鉛輸送全般がdsRNAの伝播に関わる可能性を検証すべく、一連の亜鉛輸送体の遺伝子破壊株の解析を行った。10遺伝子については遺伝子破壊株を作成する必要があった為、それらの作成をCRISPR-Cas9システム（Friedland AE et al., Nat. Methods 2013）によって行い、5遺伝子の破壊株を取得した。平成30年度は残りの5遺伝子について遺伝子ノックアウトを作成し、解析を行う予定である。また、平成29年度に引き続き、本輸送体が小胞輸送のどの過程に関与するかという点を、変異体における各種オルガネラマーカーの細胞内局在を解析することで検討する。先行研究にて、全身性RNAiに関わる遺伝子、sid-1, sid-2, sid-3, sid-5が同定されてきた。本年度以降は、これらとの遺伝学的な関係性についても明らかとしていく。また、抑圧遺伝子がdsRNAの放出と取り込みのどちらに関わるかについての知見を得るべく、線虫の体液中にdsRNAを導入し、取り込み細胞でのRNAiの効果を評価する予定である。加えて、亜鉛輸送活性に必要と予想されるアミノ酸を置換した変異体コンストラクトで機能的なレスキューができるかどうかを調査し、亜鉛輸送との関連性を証明していく。
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| Causes of Carryover |
（理由）
消耗品として、遺伝子工学（enzymes: DNA polymerase, RNA polymerase, restriction enzymes, purification kits, DNA sequencing etc.）やイメージングに要する試薬、プラスティック器具などを購入する予定であったが、一部の解析が予定通りに進まなかった、あるいは、遺伝子破壊など、一部の手法を効率的に進めることができたため、次年度使用額分の未使用金が生じた。
（使用計画）
更なる実験の効率化に勤めて、当該年度に計画していた実験を速やかに次年度に行い、遺伝子工学やイメージングに要する試薬を中心に消耗品などの購入を計画している。
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Research Products
(2 results)
