Identification of a novel endo-O-mannosidases for developing a new tool for de-glycosylation of O-glycans

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K18521
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 平山 弘人 国立研究開発法人理化学研究所, 糖鎖代謝学研究チーム, 客員研究員 (50525847)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 糖鎖 / 代謝 / 酵母 / O-結合型糖鎖

Outline of Annual Research Achievements

タンパク質への糖鎖修飾は真核生物に共通して見られる翻訳後修飾の一つであり，タンパク質自体の安定性を向上させるだけでなく，様々な生体内プロセス (細胞間相互作用，シグナル伝達，細胞分化，がん細胞の転移など)に深く関わっていることが知られている。我々は細胞質における糖鎖の分解・代謝の生物学的意義を解明するために，出芽酵母を用いて研究を行っている(1,2)。その過程で，炭素源マンノースへと変化させた細胞培養条件では，新規O -マンノシダーゼ(EOM)の活性が細胞内で上昇すること，その結果，タンパク質上のO-結合型糖鎖が切り出され，大量の遊離O型糖鎖(fOGs)が生成されることを偶然にも見出した。そこで，出芽酵母が有する新規EOM遺伝子の同定を行うことを目標とし， EOM依存的なO-結合型糖鎖切り出しの生物学的意義の解明を目指した
大きく分けて以下の２つのことを実施した。
( I ) CYC8遺伝子のbeta-エストロゲン依存的なシャットダウン株の作成・SGAによる大規模スクリーニング
cyc8株はマンノースを炭素源とした培養条件で生育阻害を示す。この表現型を指標とした網羅的スクリーニングを行うための予備実験を行い，CYC8の遺伝子発現をシャットダウン出来る株を作成した。beta-エストロゲン非存在下でのCYC8のシャットダウンの確認を行ったところ，良好な表現型(マンノース感受性）が確認できた。
( II )　破壊株シリーズを使ったfOGs生成に関わる遺伝子の探索
出芽酵母の非必須遺伝子の破壊株コレクションを用いて5000個の各遺伝子破壊株の細胞内で生成されるfOGsの定量解析を進行中である。約半分までの数の解析を行ったが，fOGの生成量が著しく現象しているような株は未だ取得できておらず，今後解析を継続して進行させる予定である。