2017 Fiscal Year Research-status Report
Video-imaging of amyloid disaggregase, Hsp104, on amyloid fibrils
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16K18524
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
中山 隆宏 金沢大学, ナノ生命科学研究所, 准教授 (00532821)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 高速原子間力顕微鏡ビルトイン用インキュベータ / アミロイド線維立体構造 / Hsp104立体構造動態のヌクレオチド依存性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
当該年度は、高速原子間力顕微鏡（高速AFM）用インキュベータの作製、Hsp104の基質となる種々の立体構造のアミロイド線維の調製、Hsp104のヌクレオチド依存的複合体形成の高速AFM観察に成功した。
高速AFM用インキュベータを必要としたのは、Hsp104活性の温度依存性の高さが高速AFM観察の成否に寄与すると考えられたためである。Hsp104のアミロイド線維脱凝集活性と共役するATP加水分解活性は室温と37℃で10倍近くも異なることを確認できたので、37℃での高速AFM観察の必要が生じた。高速AFMスキャナとサンプルチャンバーを覆い、内部に湿度保持用の水受けと加熱用ヒーター、サンプルチャンバー内に測温抵抗体の温度センサーを設置することで、インキュベータ内部を長時間、恒温、高湿に保てるようになった。
Hsp104の基質となるアミロイド線維を複数種用意したのは、当該年度当初目標の「脱凝集時のHsp104の動態が基質線維の立体構造にどのように依存するか解明する」を達成するためである。αシヌクレインの野生型と家族性パーキンソン病に見られる変異型（A30P, E46K, A53T）を大腸菌組換えタンパクとして調製、凝集線維を作製し、それぞれ立体構造が異なることを高速AFMで確認した。さらに、上記インキュベータを用いて、37℃でαシヌクレインのアミロイド線維伸長を観察できるようになった。
Hsp104のヌクレオチド依存的複合体形成の高速AFM観察は、アミロイド線維脱凝集反応の高速AFM観察時に共存する他のタンパク分子種（Hsp70/Hsp40, アミロイド線維中間体等）とHsp104を区別することと最終年度研究計画のヌクレオチド依存的なHsp104の立体構造の解明を目的として行った。当該反応液中ではほとんどのHsp104分子が同じような立体構造の複合体を形成することを確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
29年度の目標は、Hsp104によるアミロイド線維脱凝集活性が基質の立体構造にどのように依存するかを解明することだった。この計画時の目標について、現状はやや遅れていると結論づけざるを得ない。ただし、計画時には想定していなかった成果を得ることができている。
計画時の目標通りに遂行できなかった原因は、通常の室温での高速AFM観察ではHsp104によるアミロイド線維脱凝集活性を再現性良く観察できなかったこと、Hsp104の活性が室温と37℃で10倍近くも異なることを確認したこと、それにより、37℃で長時間の高速AFM観察を可能とする必要性が生じ、高速AFM用インキュベータの開発に時間を要したことにある。
ただし、開発に成功した高速AFM用インキュベータは本研究テーマ関連で別の成果もあげている。Hsp104の基質として用いるαシヌクレイン線維について、αシヌクレインの凝集は非常に遅く、通常の室温での高速AFM観察ではαシヌクレイン線維の伸長を観察することは期待できなかったが、37℃で高速AFM観察することで線維伸長の立体構造動態を観察することに成功した。
その他の現状の成果として、最終年度の計画の「Hsp104のヌクレオチド依存的な立体構造動態の解明」について、ATP依存的なHsp104分子の離合集散の一分子レベルでの高速AFM観察に成功していることが挙げられる。
以上、29年度の計画目標に対して現状はやや遅れているものの、本研究関連で別の成果と最終年度研究計画の端緒となる成果を挙げることに成功している。
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| Strategy for Future Research Activity |
開発した高速AFM用インキュベータと調製した種々の立体構造のαシヌクレイン線維を用いて、29年度目標である「基質立体構造依存的なHsp104の動態の解明」と「基質構造に応じたHsp104内部の立体構造動態の解明（最終年度計画）」を達成する。
「基質立体構造依存的なHsp104の動態の解明」では、基質線維がどのように消失していくか、Hsp104が基質線維上をどのように運動するかに着目して高速AFM観察を行い、動画解析する。「基質構造に応じたHsp104内部の立体構造動態の解明」ではHsp104分子内部に着目して高速AFM観察と動画解析を行い、基質構造に応じてHsp104内のサブユニットの運動がどのように変化するかを明らかにする。
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