細菌Ⅲ型分泌装置の回転運動に基づくエフェクター分泌機構の解明

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K18529
• Research Institution: Kyoto Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 扇田 隆司 京都薬科大学, 薬学部, 助教 (80737263)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: Ⅲ型分泌 / 緑膿菌

Outline of Annual Research Achievements

緑膿菌は注射器型のⅢ型分泌装置を介してエフェクターと呼ばれる菌タンパク質を宿主細胞内に注入し、細胞内を感染に適した環境に変えるが、Ⅲ型分泌装置のエフェクター輸送機構は解明されていない。本研究課題では「Ⅲ型分泌装置がニードル内壁にある疎水性アミノ酸らせんと逆方向に回転することでエフェクタータンパク質を輸送するのではないか」という仮説の検証を目的とする。
当該年度はまず前年度に構築した競合ELISA系を用いて緑膿菌が分泌する3種類のエフェクターを菌体内で過剰発現させるといずれも同程度の速度で分泌されることを見出した。
この分泌速度は以前に観察したⅢ型分泌装置の回転速度から見積もられるエフェクター輸送速度と同程度のオーダーであり、エフェクターの輸送速度はその種類には依らないこと、およびⅢ型分泌の回転速度とエフェクター輸送速度が相関する可能性が示唆された。
また、Ⅲ型分泌装置のエフェクター輸送過程をより詳細に評価するため、Ⅲ型分泌のin vitro評価系の構築を試みた。このために、当該年度はⅢ型分泌装置を保有する細菌ゴーストの調製条件を検討した。その結果、大腸菌で報告されているバクテリオファージφX-174由来の孔形成タンパク質Lysis proteinEを発現させてゴーストを調製する方法は緑膿菌ゴーストの調製には適用できないことがわかった。緑膿菌ゴーストの調製条件については今後、さらなる検討が必要である。
以上、これまでの研究において、Ⅲ型分泌装置の回転速度とエフェクター輸送速度の相関を間接的に示すことができた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当該年度までに緑膿菌を用いてⅢ型分泌装置の回転速度とエフェクター輸送速度の間の相関性を間接的に示唆することはできた。しかし、当初目的である回転-分泌相関の直接的な解析はエフェクター輸送速度のリアルタイム評価およびⅢ型分泌のin vitro評価系の構築が進んでいないため、達成できていない。そのため、現在の進捗状況は当初計画からはやや遅れている。

Strategy for Future Research Activity

本研究課題の目的である「Ⅲ型分泌装置がニードル内壁にある疎水性アミノ酸らせんと逆方向に回転することでエフェクタータンパク質を輸送するのではないか」という仮説の検証を達成するため、まずはニードル内疎水性らせん欠損緑膿菌を作製し、これまでに構築したⅢ型分泌のin vitro評価系を用いてエフェクター分泌および装置の回転運動への影響を評価することを優先して行う。これにより、Ⅲ型分泌におけるニードル内疎水性アミノ酸らせんの重要性を示すことができ、これまでに示した回転速度とエフェクター分泌速度との相関を併せて間接的にではあるが、上記仮説の検証を行う。
その後、Ⅲ型分泌装置の回転-分泌相関を直接的に評価するためのⅢ型分泌のin vitro評価系およびエフェクター輸送のリアルタイム評価系の構築に取り掛かることにする。

Causes of Carryover

当該年度はおおむね計画通りに使用したが、前年度からの繰り越し金があったため、次年度繰り越し金が発生した。この繰り越し金については、次年度実験の物品費に充てる予定である。