細胞内アクチンのメカノセンサーとしての機能検証

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K18530
• Research Institution: Miyakonojo National College of Technology
• Principal Investigator: 野口 太郎 都城工業高等専門学校, 物質工学科, 講師 (90615866)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: アクチン / メカノセンサー / 構造

Outline of Annual Research Achievements

アクチンフィラメントは様々な細胞機能において、主たる役割を果たす重要なタンパク質であるが、そのアクチンフィラメントの構造には多型性があり、このことがアクチン結合タンパク質などを介した機能発揮に重要であるとされている。また、過去の我々の実験において、細胞内のアクチンフィラメント構造が力によって変化することも示唆されている。そこで本申請における初年度は、アクチンフィラメントが力センサーとしての機能を有していることを確認するため、精製アクチンおよび細胞に力を加えるためのシステム構築、さらに構造変化検出のためのFRETアクチンの調製を行った。
具体的には、ガラスニードルとマニピュレーターを用いてアクチンフィラメント、または細胞を押したり、引いたりすることができるようにニードルの修飾方法等を検討した。検討の結果、ガラスニードルにはアビジン-ストレプトアビジンシステムを用いた修飾を行い、アクチンを結合させることに決定した。また、マニピュレーターの設置も行った。実験系については概ね確立できた。
さらに構造変化検出のためのFRETアクチンの調製についても同時並行して行った。FRETアクチンのための変異アクチンの調製には、細胞性粘菌を発現細胞として用い、発現、精製後にアクセプターとドナーとなる蛍光色素を部位特異的に標識した。
今後は調製したFRETアクチンを用いて、細胞内外におけるアクチンフィラメント構造の力依存性について調査する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

アクチン発現のための細胞状態が悪い状態が続き、構造検出のためのFRETアクチンの調製が遅れたことが主な要因になっている。現在は改善されており、精力的にFRETアクチンの調製を行っている。
また、FRETアクチンの細胞への導入効率についても以前よりも低下しており、現在、改善に向けて条件の検討を行っている。

Strategy for Future Research Activity

初年度で実験系については概ね確立できた。今後は、調製したFRETアクチンをアクチン構造状態の指標にn vitro、in cell条件下でアクチンフィラメントに力を加え構造状態の変化を確認する予定である。