2017 Fiscal Year Research-status Report
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16K18533
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
柳川 正隆 国立研究開発法人理化学研究所, 佐甲細胞情報研究室, 研究員 (70609792)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | GPCR / 1分子イメージング / 拡散動態 / シグナル伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Gタンパク質共役型受容体(GPCR)は低分子薬の約30%の標的になるなど、創薬において主要な位置を占めている。従来、GPCRの活性評価は下流の細胞応答の計測に依存してきたが、オーファン受容体では下流が未知の場合も多く、何を薬効評価の指標とすればよいか分からない。したがって、GPCR自体を計測して活性を定量する手法の開発が求められる。
昨年度までに我々は、代謝型グルタミン酸受容体(mGluR3)の生細胞内1分子イメージングを行い、リガンド依存的な活性の変化と相関して拡散動態が変化することを示した。さらに、百日咳毒素によりGタンパク質との相互作用を阻害すると拡散が速いmGluR3の割合が増加することを明らかにした。本年度は、Gタンパク質とmGluR3の2色同時1分子計測を行い、両者の複合体の拡散動態を定量した。その結果、mGluR3は活性・不活性状態を問わずGタンパク質と短期間相互作用することが明らかになり、この相互作用は百日咳毒素により阻害されることが示された。また、Gタンパク質と相互作用中のmGluR3は速い拡散状態を採る確率が高いことが示され、昨年度の百日咳毒素による阻害実験から間接的に示唆された結果を直接的に検証できた。
また、当初計画していたmGluRとは異なるファミリーに属するGPCR8種の1分子計測については昨年度中に完了したため、本年度は305種のGPCRについて蛍光標識用のHaloTagを融合したクローンの作製を行った。シームレスクローニングとランダムPCRを組み合わせてスクリーニングを行うことで、HaloTag融合GPCRの作製は順調に進み、計314種のGPCRについて1分子イメージングを可能な状況を構築できた。今後はGPCRの拡散機能相関の一般性をより幅広く検証していきたい。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当初の計画では、GPCRの拡散・機能相関の一般性を検証する目的で、mGluR3を含む9種のGPCRの1分子イメージングを行う予定であったが、リガンド依存的に拡散動態が変化することの検証は昨年度中に完了した。本年度は、より幅広いGPCRでの検証を可能にすべく、新たに305種のGPCRの遺伝子を入手し、蛍光標識用のHaloTag融合cDNAを1分子イメージングに適した低発現量ベクターに挿入することを完了した。
また、mGluR3については当初の予定通り、Gタンパク質との2色同時1分子イメージングを行い、Gタンパク質と複合体を形成した際にmGluR3は速い拡散状態をとる確率が上がることを直接的に明らかにした。特に、インバースアゴニストが飽和濃度存在する条件下でも、両者の複合体が形成されることが明らかになり、Class C GPCRに属するmGluRでもClass A GPCRと同様にGPCRとGタンパク質のプレカップリングが生じることが示された。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度には、平成29年度までの研究内容をまとめた論文を発表する予定である。また、昨年度に国内出願した本研究に関する特許を米国にも出願予定である。
さらに、Gタンパク質と並び、GPCRのシグナル伝達に重要な役割を担うアレスチンについても2色同時1分子計測を用いてGPCRと相互作用中の拡散状態を定量することでGPCRの拡散・機能連関についての理解を深めたい。
また、平成29年度に作製した305種のHaloTag融合GPCRに関しても順次1分子イメージングを行い、本研究の適用可能範囲を検証したい。
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| Causes of Carryover |
平成29年度は、主にGPCRのリガンド等の計測に用いる消耗品を中心に購入した。端数は平成30年度に繰り越し、1分子計測・GPCRの活性定量に用いる試薬類・消耗品類の購入に充てる予定である。
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[Presentation] Evolutionary acquisition of low thermal noise of cone pigments for scotopic vision2017
Author(s)
小島 慧一, 松谷 優樹, 柳川 正隆, 山下 高廣, 今元 泰, 久冨 修, 山野 由美子, 和田 昭盛, 七田 芳則
Organizer
日本生物物理学会第55回年会, 熊本, 2017
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[Presentation] Comparison of thermal activation rates between vertebrate visual pigments and pinopsin2017
Author(s)
山下 高廣, 佐藤 恵太, 小島 慧一, 酒井 佳寿美, 松谷 優樹, 柳川 正隆, 山野 由美子, 和田 昭盛, 岩部 直之, 大内 淑代, 七田 芳則
Organizer
日本生物物理学会第55回年会, 熊本, 2017
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