2017 Fiscal Year Research-status Report
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16K18556
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| Research Institution | National Institute of Genetics |
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Principal Investigator |
平野 孝昌 国立遺伝学研究所, 系統生物研究センター, 特任研究員 (30594999)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | P-body / 雄性生殖細胞 / 精子幹細胞 / NANOS2 / DND1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
mRNA分解の場として機能する細胞質顆粒P-bodyは、マウス雄生殖細胞系列の分化過程において重要な役割を果たす。P-body構成因子の欠損体解析により、P-bodyを介したmRNA制御機構は、始原生殖細胞から雄性生殖細胞への分化過程、及び精子幹細胞の維持に必須であることが明らかとなっている。P-bodyには、microRNA (miRNA) 経路因子が局在する。miRNAは、結合したmRNAをP-bodyへと移送し、分解を促進する。そこで、miRNA経路が雄性生殖細胞系列の分化過程に重要な役割を担うと考えられた。しかし、miRNA経路因子欠損マウスは、雄性生殖細胞系列において、明確な表現型を示さなかった。このことは、miRNA経路以外のP-body関連因子が、重要な役割を果たすことを示唆する。
雄性生殖細胞及び精子幹細胞では、その維持に必須なRNA結合タンパク質NANOS2とDND1が複合体を形成し、P-bodyに局在することが知られている。このNANOS2-DND1複合体は、標的遺伝子mRNAの分解を促進することも報告されている。従って、NANOS2-DND1標的遺伝子mRNAの解明が、雄性生殖細胞系列におけるP-bodyを介したmRNA制御の主要な役割を果たしていると考えられる。これまでに、Nanos2欠損マウス精巣における遺伝子発現解析より、NANOS2-DND1の標的候補遺伝子セットは絞り込まれていたが、直接の標的遺伝子mRNAの解析は不十分であった。申請者は、生殖細胞特異的であるNANOS2-DND1の機能を、培養系体細胞であるNIH3T3で再構成することに成功した。この再構成細胞を用いて直接制御を受けるmRNAをスクリーニングしたところ、5遺伝子mRNAが同定された。現在、これら5候補遺伝子に関して、マウス生殖細胞における機能解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
マウス雄性生殖細胞系列におけるP-body機能の解明を進める為、miRNA経路のみでなく、NANOS2-DND1に関しても展開している。
これまで、NANOS2-DND1発現細胞の僅少性、及び標的候補遺伝子の多様性より、雄性生殖細胞におけるNANOS2-DND1の標的遺伝子mRNAの同定は、生化学・遺伝学的解析のいずれの手法においても困難であった。本研究過程で、生殖細胞特異的なNANOS2-DND2機能を、体細胞系培養細胞で再構成することに成功した。この樹立したNANOS2-DND1再構成細胞を駆使することで、僅少な生殖細胞を用いることなく、NANOS2-DND1の標的遺伝子mRNAの認識機構の解明、及び標的mRNAの同定が可能であると考えられる。これまで、既存のNANOS2-DND1標的であるSohlh2及び Dazl mRNAが知られているが、これらを用いて、以下のことを展開した。
（1）標的遺伝子mRNAはP-bodyへと輸送され、mRNA分解を促進されること。また、その最終産物であるタンパク質が減少すること。（2）Sohlh2 mRNAを用いて、NANOS2-DND1認識部位の同定に着手し、その領域を狭めつつあること、また、Dazl mRNAでも同様の解析を進めている。（3）（1）の知見から、NANOS2-DND1標的mRNAの検証が可能と考えられ、新規の標的mRNAのスクリーニングに着手した。途中段階ではあるが、現在、5遺伝子を新規標的候補として見出した。
よって、NANOS2-DND1の標的mRNA同定に向けた基盤が整った。NANOS2-DND1標的遺伝子は、生殖細胞の雄性分化に関わることや、及び精子幹細胞維持に影響を与える因子であると強く示唆される。従って、本研究を展開することで、当初の想定以上の成果をあげることが期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
NANOS2-DND1再構成細胞を用いて、既存の標的遺伝子mRNAであるSohlh2及びDazlのNANOS2-DND1認識部位の最小単位を同定する。また、Sohlh2とDazlの標的部位の共通項から、NANOS2-DND1のRNA認識構造を明らかにする。さらに、得られたNANOS2-DND1認識構造から、新規標的候補遺伝子を検索し、その候補遺伝子をNANOS2-DND1再構成細胞で検証する。そこから得られた候補遺伝子と、先だって見出した5候補遺伝子に対して、マウス個体を用いた検証を行う。マウスによる解析では、以下のものを作成する。
（1）過剰発現：標的候補遺伝子を条件的過剰発現可能なES細胞株を樹立し、そのES細胞株を用いてキメラ解析を行う。ES細胞由来の生殖細胞の表現型を検証することで、過剰発現による影響を解析する。（2）遺伝子欠損解析：CRISPR-Cas9を用いて、マイクロインジェクション法による欠損体を樹立し、生殖細胞における遺伝学的機能を明らかにする。NANOS2-DND1は遺伝子発現を負に制御することから、雌性生殖細胞分化や精子幹細胞分化などに影響がみられると見込まれる。欠損体が生殖細胞の性分化以前に胎生致死を示す場合、適宜ES細胞を用いた条件的遺伝子欠損体の作成に切り替える。（3）NANOS2-DND1認識部位欠損体：CRISPR-Cas9を用いて、NANOS2-DND1認識部位の欠損ES細胞株を樹立し、キメラ解析によってその表現型を検証する。この表現型は、過剰発現と類似であることが見込まれる。また、NANOS2-DND1は同時に複数のmRNAを制御することで表現型を発揮することも想定される。複数遺伝子の認識部位欠損ES細胞株樹立も視野に入れる。
これらの解析を通して、NANOS2-DND1標的遺伝子の同定、及びその遺伝子機能を明らかにする。
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