2017 Fiscal Year Research-status Report
葉緑体チラコイド内腔におけるレドックス制御機構の解明
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16K18573
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
桶川 友季 京都産業大学, 総合生命科学部, 研究助教 (10582439)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | シロイヌナズナ / 光合成 / チオレドキシン / レドックス / 還元力伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高等植物の葉緑体では、ストロマだけではなく、チラコイド膜を隔てた内腔にもレドックス制御システムが存在することがわかってきた。チラコイド膜内腔には少なくとも80のタンパク質が局在し、そのうちの30を超えるタンパク質がジスルフィド結合を持ち、レドックス制御受ける可能性が示唆されている。これの研究からLTO1とHCF164タンパク質がそれぞれチラコイド内腔に局在するタンパク質の酸化と還元を担うと考えられてきている。変異体の解析からチラコイド内腔におけるレドックス制御の重要性は明らかになったが、その詳細な分子機構はこれまでのところわかっていない。
本年度はLTO1とHCF164およびHCF164の上流で機能すると考えられているCcdAの遺伝子の発現解析をおこなった。LTO1、HCF164、CcdAと遺伝子の発現パターンが類似している遺伝子を選択し、タンパク質がルーメンに局在すると予測されるタンパク質を候補とした。これらのタンパク質の解析をおこなうためにそれぞれのT-DNA挿入株を取得した。その結果、ジェノタイピングをおこなうことによって変異体を単離することが出来た。さらに野生株とのバッククロスを終了し、次年度に表現型の解析をする準備が完了した。
さらに、HCF164の下流で働くと示唆されているSOQ1タンパク質の解析をおこなった。SOQ1はルーメンにTrx様ドメインを持つタンパク質で非光化学的クエンチング(NPQ)の制御に関わっていることが明らかになっているがその詳細なメカニズムはわかっていない。そこでSOQ1がレドックス制御を受けるかを明らかにするためにin vivoでのSOQ1のレドックス状態を調べた。またCcdAとHCF164に還元力を寄与するTrxを明らかにするためにTrx fとTrx mの過剰発現株を作製し、過剰発現株を取得することが出来た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実施計画にあげていた通り、Trxの過剰発現株を取得することが出来た。Western Blottingによってタンパク質の蓄積量が増加していることも既に確認している。この過剰発現株を用いて次年度にすぐに解析が出来る状態である。
本年度、SOQ1のレドックス状態を調べるために暗条件と明条件で処理した植物の解析をおこなったが、レドックス状態を明らかにすることが出来なかった。SOQ1は分子量が104kDaと大きいため、これまでタンパク質のレドックス状態を調べるために用いていた方法では検出できない可能性が考えられる。次年度はSOQ1のレドックス状態を明らかにするために他の方法を用いておこなうこととした。新たな方法をおこなうための準備を進めている状況である。
またLTO1の解析をおこなうために抗体を作製したが、LTO1を特異的に認識する抗体を作製することは出来なかった。抗体の作製は次年度に改めておこなう。
そのため、当初の計画を変更し遺伝子の発現解析からチラコイド内腔に局在するレドックス制御を受けるタンパク質の同定を目指すこととした。チラコイド内腔のレドックス制御に関与するHCF164、CcdA、LTO1は共発現し、その標的と考えられるSOQ1も同様の発現パターンを示すことを見つけた。そのためその他の標的タンパク質も同様の発現パターンを示すと考えられる。すでに候補遺伝子をしぼりその変異株の取得も終了しバッククロスも終えているため、次年度にすぐに解析をおこなうことのできる状況である。
このように当初の計画とは変更が生じたが概ね順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、葉緑体チラコイド内腔におけるレドックス制御機構の解明を目指して研究をおこなう。本年度、遺伝子発現解析からチラコイド内腔に局在し、HCF164とLTO1によりレドックス制御を受ける可能性のある候補タンパク質をしぼった。またT-DNA挿入株を取得し、変異体を単離し、バッククロスも終えている。次年度はこれらのT-DNA挿入変異株を用いて生理学的な解析をおこなう。具体的にはクロロフィル蛍光測定装置を用いて光合成能を評価し、候補タンパク質の欠損が与える影響を調べる。候補タンパク質がHCF164やLTO1の下流で働くタンパク質であれば変異体も同様の表現型を示すはずである。これらの解析では標的タンパク質を同定できない場合は共免疫沈降により相互作用するタンパク質を単離し同定することを目指す。共免疫沈降をおこなうためにも本年度は作製することが出来なかったLTO1の抗体を再度作製する。
またSOQ1のレドックス状態を調べるためにこれまでとは異なる方法でタンパク質を検出し、SOQ1のレドックス状態を明らかにする。SOQ1でレドックス状態が変化する条件が見つけることが出来れば、今後同定される他の標的タンパク質の生理的寄与の評価にも非常に役立つ。SOQ1のレドックス状態の検出には野生株だけでなく、Trxの欠損変異株および本年度に作製したTrxの過剰発現株を用いる。
さらにTrxからCcdA、HCF164への還元力伝達システムを明らかにするために、Trxの欠損変異株およびTrxの過剰発現株を用いて、CcdAおよびHCF164のレドックス状態を調べる。
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| Causes of Carryover |
今年度購入予定の備品を来年度の購入に変更したため。研究遂行上、出張の必要がなくなったため。
物品費…備品、消耗品の購入。
旅費…学会への参加。
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