2017 Fiscal Year Research-status Report
孵化酵素の多重コピー遺伝子がもたらすメダカ属魚類の孵化環境への適応進化
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16K18593
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| Research Institution | Sophia University |
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Principal Investigator |
川口 眞理 上智大学, 理工学部, 准教授 (00612095)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | hatching enzyme |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度、メダカ属5魚種のBACライブラリーを用いてHCE遺伝子のクラスター構造を明らかにしている。その結果、メダカ属の3つの系統のうち、ラティペスグループのみでHCE様遺伝子であるAHCEが見つかった。AHCEはまだ機能が明らかになっていない。そこで今年度は、AHCE遺伝子の機能解析を試みた。まず、RT-PCR法でミナミメダカのst.25, 28, 33, 39の胚におけるAHCE遺伝子の発現を孵化酵素HCEとLCE合わせて調べた。その結果、st.25から弱いながらも発現が検出でき、st.33で最も発現量が上昇し、その後発現量が減少していた。また、in situハイブリダイゼーション法で発現局在を調べた結果、孵化腺細胞に局在していることが分かった。これらの発現パターンはHCEやLCE遺伝子と一致していた。次に、AHCEの組換えタンパク質を大腸菌の系で作製し、0～0.75 M NaCl存在下における卵膜分解活性を調べた。コントロールとしてHCEの組換えタンパク質を作製し、活性を比較してみると、AHCEはHCEと比べて0.1倍以下の活性しかなく、卵膜分解活性はほとんどないことが分かった。
メダカだけでなく、ゼブラフィッシュなど他の魚種においても孵化酵素遺伝子が多重コピー遺伝子ととして存在し、そのうちの少なくとも1つが発現量が弱いものが見つかる。これらの発現量の低い遺伝子は卵膜分解以外の機能を持つ可能性がないだろうか？孵化酵素はプロ型酵素が生体内で合成され、分泌時にプロセッシングを受けて成熟酵素になるが、プロセッシング酵素はまだ明らかになっていない。そこで、プロセッシング酵素の可能性を検証するために、プロ型HCEの組換えタンパク質を作製し、AHCEで処理することによりHCEがプロセッシングされるのかを調べた。その結果、弱いながらもAHCE処理前に比べて処理後のプロ型HCEの活性が上昇した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度明らかになった孵化酵素様遺伝子AHCEの発現を明らかにし、機能解析を進めることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究実績の概要に記載したように、AHCEがプロセッシング活性を示す可能性が示唆される結果が得られた。しかしながら、組換えタンパク質の活性が低く、まだその機能については明確になっていない。今後はフォールディング条件を検討する、あるいは、わずかながらも活性のある組換えタンパク質が得られているので合成量を増やすなどによって対処し、活性の高い組換えタンパク質の作製を進める。得られた組換えタンパク質を用いて、卵膜分解活性やプロセッシング活性について更なる検証を進める。また、CRISPR/Cas9を用いたAHCE遺伝子のノックアウトの作製を試み、AHCE遺伝子の機能解析を進める。
BACライブラリーを用いたHCE遺伝子のクラスター構造解析により、AHCE遺伝子はミナミメダカには1コピー存在するのに対し、ルソンメダカには2コピー存在することを明らかにしている。一方、孵化酵素HCE遺伝子はミナミメダカには4コピーあるのに対し、ルソンメダカには1コピーしかない。そのため、ルソンメダカではAHCEがHCEの機能を補完している可能性も考えられる。そこで、ルソンメダカのAHCEについても組換えタンパク質を作製し、卵膜分解活性を調べる。さらに、CRISPR/Cas9を用いたルソンメダカのAHCE遺伝子のノックアウト個体を作製し、機能解析を進める予定である。
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| Causes of Carryover |
理由：残高がわずかであり、試薬類を購入できる金額ではなかったため、次年度に繰り越した。
使用計画：2018年度に消耗品の購入資金として使用する。
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Research Products
(23 results)
