2017 Fiscal Year Research-status Report
イネKNOX・BLH転写因子複合体によるSAMの維持機構の解明
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16K18637
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| Research Institution | National Institute of Genetics |
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Principal Investigator |
津田 勝利 国立遺伝学研究所, 実験圃場, 助教 (30756408)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | メリステム / 節間伸長 / 介在分裂組織 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
茎頂分裂組織(SAM)は植物の地上部全体の器官を生み出す組織である。本研究では、イネにおいてSAMの形成・維持に不可欠なKNOX転写因子のコファクターと考えられるBLH転写因子PVP1およびPVP2に着目し、機能解明・下流遺伝子の同定をおこない、KNOX-BLH転写因子複合体の標的遺伝子の発現制御メカニズムを解明する。
H29年度は、pvp1およびpvp2変異体の表現型調査をおこない、pvp1/2二重変異体は胚発生の段階でSAMを形成できず致死となること、またpvp1またはpvp2の片方をヘテロ、もう一方をホモとした個体では、出穂遅延・花序および節間異常をきたすことがわかった。PVP1について、プロトプラストにおけるBiFCアッセイをおこない、KNOXであるOSH1と相互作用することを確認した。
クロマチン免疫沈降(ChIP)に向けては、抗PVP1抗体の精製・評価をおこなったが、精製後に抗体の凝集が起こり、力価が極度に下がってしまったため、ChIP実験に耐えうる抗体を得るに至っていない。また、RFPを導入したPVP2ゲノムコンストラクトを作成し、pvp1/2二重変異体に導入したところ、シュート形成は回復したが、種子稔性は回復しなかった。そこでPVP2について相同組換えを用いたRFPノックイン系統を作出した。PVP1についてもRFPを持つゲノムコンストラクトを作成し、pvp1/2二重変異体およびpvp1-/-PVP2+/-個体に導入し、シュート形成が回復することを確認済みである。現在、これらの形質転換体を生育中である。
研究成果の発表としては、イネ科の茎内構造を詳細に観察ためのマイクロCTを用いた手法を確立し、論文として発表した（Maeno and Tsuda, 2018)。本手法はイネの茎内構造観察にも適用でき、節間成長における異常を記述する上で有用であることも確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
H28年度、ゲノム編集により作成したpvp1/2二重変異体が予想よりシビアな表現型を示したため、それぞれの単独変異体を交配し、二重ヘテロ個体の自殖後代の解析をおこなう方針に切り替えていた。H29年度は計画通り表現型調査をおこない、節間伸長・花序形成において様々な異常を来すことが明らかになったが、同時に重度の花成遅延が観察され、トランスクリプトーム解析のためのサンプルのステージ合わせにより慎重な検討が必要であることがわかった。そのため、H30年度に発生ステージの詳細な検討とトランスクリプトーム解析を実施することにした。
また、免疫沈降に用いる予定のPVP1抗体が、精製後に力価を十分に保てなかったため、これらの実験を実施できなかった。代替案としてRFPを付加したPVP1およびPVP2のコンストラクトを導入した形質転換体を作成した。今後これらと市販のRFP抗体を用いて免疫沈降の材料とする予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度(H30)は、節間の発生異常を花成遅延を考慮して詳細に観察し、LMDによる遺伝子発現解析データを取得する。
免疫沈降実験に向けては、良質の精製抗体が得られていないため、RFPを導入したPVP1およびPVP2をもつ植物体と、市販の抗RFP抗体ビーズを用いた実験系に切り替えて免疫沈降をおこなう。また、これらRFP導入個体における蛍光観察を詳細におこない、PVP1およびPVP2の発現パターンを調査する。
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| Causes of Carryover |
前述の理由により、H29年度に実施予定であったpvp1/2変異体におけるトランスクリプトーム(RNAseq)およびChIPseq解析をH30年度に行うことになった。したがって、その関連試薬およびNGS外注費用を次年度(H30)に繰り越したため。
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