重金属過剰で誘導されるミトコンドリア選択的オートファジーの分子機構

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K18668
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture
• Principal Investigator: 齋藤 彰宏 東京農業大学, 応用生物科学部, 助教 (10610355)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: オートファジー / ミトコンドリア / 重金属 / 環境適応 / オルガネラ

Outline of Annual Research Achievements

タバコ培養細胞にニッケルを添加すると、ニッケルを高濃度に集積する小胞様構造（ニッケル集積小胞、NIVs)が生じる。このNIVsは、ミトコンドリアを集積した自食胞（オートリソソーム）であることをこれまでに明らかにした。
本年度、ニッケルがミトコンドリアに集積されたことによる異常が原因でミトコンドリア選択的なオートファジーが誘導されたと考え、タバコ培養細胞からミトコンドリアや自食胞を単離して、呼吸活性を測定した。この結果、ニッケル処理で単離される自食胞が増加することまでは明らかになったが、ニッケル処理によってミトコンドリアの呼吸鎖の機能にどのような影響があったのかについては引き続き追加の解析が必要である。
一方、ミトコンドリアを蛍光タンパク質tagRFPで標識して形態を観察したところ、ニッケル処理後にミトコンドリア形態が異常となることが確認された。ミトコンドリア選択的なオートファジーが引き起こされる要因を明らかにするために、引き続き、ニッケルがミトコンドリア機能や形態に及ぼす影響を明らかにする必要がある。
また本年度は、タバコ培養細胞と同じ現象をタバコ植物体でも観察できることを明らかにした。特に根ではニッケル処理後の早い時間から特定のオートファジー関連遺伝子の発現が上昇することが明らかになった。また、シロイヌナズナ培養細胞とシロイヌナズナ植物体においてもある種の重金属でオートファジーが誘導されることを確認した。しかし、その誘導パターンはタバコ細胞とは明らかに異なり、植物種間や重金属の種類によって誘導されるオートファジーのタイプが異なることが判明しつつある。
以上、ここまでに明らかにした内容を現在投稿準備中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初年度（H28年度）に計画していた実験項目の進展状況は以下の通りである。
（1)タバコ細胞から自食胞を単離し解析を行った。ニッケル処理で有意に自食胞が増加することが確認され、仮説を裏付けるデータを得た。一方、単離ミトコンドリアは当初、連数間で純度や収量にばらつきがあった。この理由として、ニッケル障害により異常となったミトコンドリアが精製過程で失われていたことが原因であると考えられた。そこで、従来の密度勾配遠心法からより温和な分画遠心法に切り替え、短時間でミトコンドリアを回収・精製することにした。その結果、連数間で安定して高純度のミトコンドリアを得ることができるようになった。この試料で引き続き解析を進める。
（2）については、ミトコンドリアを標的としたオートファジー経路を蛍光タンパク質で可視化することに成功した。現在、ミトコンドリア以外にプラスチドやATG8を蛍光タンパク質で標識した細胞株を作出し、これらにニッケルや重金属を添加した場合の影響を解析中である。興味深いことに、ニッケル添加後数十分から数時間の間で、ミトコンドリア形態に異常が起こる様子が観察されている。この形態の異常はこれまでに知られているものとは異なることから、引き続き詳細な経時変化と定量データを得る計画を立てている。
（3）の既知オートファジー関連遺伝子の発現解析についても、タバコとシロイヌナズナの各培養細胞系、および各植物体それぞれで20遺伝子程度の解析を行い、重金属で誘導される既知オートファジー遺伝子の種類や、誘導される時間帯が概ね特定できた。ここで明らかにされた条件をもとにH29年度に網羅的な遺伝子発現解析を実施する予定である。
以上のように、予想した結果に加えて、新たに重金属がミトコンドリアの形態に及ぼす影響も確認できた。これらの点から、計画したすべての項目が順調に進展していると言える。

Strategy for Future Research Activity

前年度に、重金属でオートファジーが誘導される条件を明らかにしたことから、これを踏まえて、今年度は予定意どり次世代シーケンサーを用いたトランスクリプトーム解析を実施する。これにより、重金属誘導型のオートファジーに関わる新規遺伝子の探索を進める。
また、オートファジーに必須な遺伝子に由来するATG8およびJoka2（NBR1)にHisタグをつけた状態で高発現する細胞株を作成し、今年度内に共免疫沈殿を実施したい。これにより、重金属処理後に、ATG8やJoka2（NBR1)と相互作用するタンパク質の特定を試みる。また、タンパク質が特定された場合には、そのタンパク質とミトコンドリアを標的とするオートファジーとの関連性を解析する。
ニッケル処理によってミトコンドリアの形態異常が確認されたことから、引き続きミトコンドリアのどこにニッケルが作用しているか特定を進める。また、異常ミトコンドリアを認識するメカニズムとして、ミトコンドリア表層タンパク質のユビキチン化が関与するのではないかと予想している。この予想の妥当性を明らかにするために、単離ミトコンドリアの表層タンパク質のユビキチン化状態を解析する。また、高度にユビキチン化されるタンパク質が検出された場合には、そのユビキチン化タンパク質をLC-MS/MS解析により特定する。
これら複数のアプローチにより、ミトコンドリアを標的とするオートファジーに関与する候補因子を特定し、メカニズムの解明につなげる。

Causes of Carryover

前年度に計画していたものはほぼすべて購入し、予定通りに使用させていただいた。初年度の残額は、今年度に始動するトランスクリプトーム解析やプロテオーム解析に初年度に比べ多額を使用することから、全額を使いきるのではなく、今年度の解析に少しでも充当できるよう繰り越しをすることとした。

Expenditure Plan for Carryover Budget

本年度のトランスクリプトーム解析やプロテオーム解析では消耗品も多数使用する。残額の7003円はこの過程で生じる消耗品（プライマー、抗体等）に使用する予定である。