2016 Fiscal Year Research-status Report
DNA/RNAミスマッチ認識蛋白質を用いた高精度逆転写による相同miRNAの識別
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16K18680
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| Research Institution | Osaka Medical College |
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Principal Investigator |
福井 健二 大阪医科大学, 医学部, 助教 (00466038)
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2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | miRNA / ミスマッチ / 逆転写反応 / 高度好熱菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では、相同 miRNA ファミリーの簡便な識別に利用できる高精度逆転写反応の構築を目指す。これまでに耐熱性の新規ミスマッチ認識タンパク質 LLBP を同定していた。今年度は LLBP を上記課題に適用するために、その生化学的性質を詳細に解析した。
LLBP は 3 塩基以上のループ状構造を持った DNA/RNA ハイブリッドから成るミスマッチに特異的に結合し、10 塩基程の大きなミスマッチを特に強く認識した。また、LLBP によるミスマッチへの特異的な結合は、DNA/DNA から成るミスマッチにおいても確認できた。real-time PCR 装置を用いて、LLBP が、ミスマッチを持つプライマーからの DNA の増幅を抑制できることを確かめた。LLBP に存在する RXXXH motif が核酸の結合に決定的な役割を果たしていることを、部位特異的変異導入により確かめた。さらなる LLBP の機能解析のために、LLBP の結晶構造解析を進めた。結晶化条件スクリーニングの結果、LLBP の結晶を得ることに成功し、放射光を用いて X 線回折データを取得した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
LLBP 結晶の位相が決定できず、構造解析が予定より遅れた。今後、重原子を用いた位相決定により立体構造を解き、LLBP の機能解析を完了する。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、LLBP の回折データに位相をつけ、立体構造解析を明らかにし、LLBP にとって最適となるプライマーの形状を決定する。そのプライマーを用いて、鋳型 miRNA からの非特異的な DNA 増幅を LLBP が抑制できる条件を検討する。
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| Causes of Carryover |
LLBP の結晶構造解析において、X 線回折データの位相決定が予定より遅れた。それに伴い、その後に行うはずであった機能解析実験を行わなかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
LLBP の結晶構造解析の位相決定の準備は整っており、次年度に計画通りに機能解析実験を行う予定である。結果、当初申請した額と同じ費用が必要になる。
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Research Products
(1 results)
