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2017 Fiscal Year Annual Research Report

Rational design and application of artificial L-amino acid dehydrogenases from sequence database

Research Project

Project/Area Number 16K18688
Research InstitutionUniversity of Shizuoka

Principal Investigator

中野 祥吾  静岡県立大学, 食品栄養科学部, 助教 (80748541)

Project Period (FY) 2016-04-01 – 2018-03-31
Keywords祖先型設計 / X線結晶構造解析 / 反応機構 / L-スレオニン脱水素酵素
Outline of Annual Research Achievements

H29年度は、短鎖型L-スレオニン脱水素酵素 (TDH)の基質選択性拡大に向けて、祖先型設計法により人工L-スレオニン脱水素酵素を新たに設計した。H28年度に取得した、87個のTDH候補配列から構成されるライブラリを用いて、MAFFTによる多重配列アラインメントを行い、MEGAによる最尤法を用いた系統解析を行ったのち、FASTMLを用いて、TDHの祖先型配列 (AncTDH) の設計を行った。AncTDHに関して人工遺伝子合成を行い、pET15bベクターにサブクローニングを行い、大腸菌発現系を用いてAncTDHを大量発現させた。結果30mg/L以上のAncTDHを得ることができた。精製したAncTDHに関して各種酵素化学解析を行った結果、AncTDHは微弱ながらR-3-ヒドロキシ酪酸やS-3-ヒドロキシ酪酸に活性を有することが判明した。
加えて新規に取得した単量体型TDH (mtTDH) について構造機能解析を行い、TDHの生成物脱離機構の解明を行った。X線結晶構造解析によりmtTDHに関してapo, NAD+結合型、NAD+-L-Ser結合型、及びNADH-2-アミノ-3-ケトブチル酸 (AKB) 結合型の4構造を1.2-1.9Åという高分解能で決定した。フラグメント分子軌道法 (FMO法) を用いたタンパク質ーリガンド間の相互作用解析、及び各種変異体を用いた酵素化学解析により、mtTDHのAsp179が反応完了を感知するセンサーとして働き、TDHの開閉構造の切り替えを制御しながら、生成物の脱離を行っていることを予測した。本成果について、Biochemistry誌にて発表を行った。

  • Research Products

    (4 results)

All 2017

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 1 results) Presentation (1 results) (of which Invited: 1 results) Book (1 results)

  • [Journal Article] Product Release Mechanism Associated with Structural Changes in Monomeric l-Threonine 3-Dehydrogenase2017

    • Author(s)
      Motoyama Tomoharu、Nakano Shogo、Yamamoto Yuta、Tokiwa Hiroaki、Asano Yasuhisa、Ito Sohei
    • Journal Title

      Biochemistry

      Volume: 56 Pages: 5758~5770

    • DOI

      10.1021/acs.biochem.7b00832

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Rational identification of aggregation hotspots based on secondary structure and amino acid hydrophobicity2017

    • Author(s)
      Matsui Daisuke、Nakano Shogo、Dadashipour Mohammad、Asano Yasuhisa
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 7 Pages: 1-12

    • DOI

      DOI:10.1038/s41598-017-09749-2

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] Development of INTMSAlign software to design artificial proteins and assign enzymes2017

    • Author(s)
      Shogo Nakano, Sohei Ito and Yasuhisa Asano
    • Organizer
      2017年度日本生物工学会大会 (国際シンポジウム)
    • Invited
  • [Book] 生物工学会誌2017

    • Author(s)
      中野 祥吾
    • Total Pages
      1
    • Publisher
      日本生物工学会

URL: 

Published: 2018-12-17  

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