牛ウイルス性下痢ウイルスが持つ免疫誘導能力の応用に向けた基盤研究

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K18796
• Research Institution: Nippon Veterinary and Life Science University
• Principal Investigator: 塩川 舞 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 助教 (00739162)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 牛ウイルス性下痢ウイルス / END(-)ウイルス / END(+)ウイルス / 自然免疫反応

Outline of Annual Research Achievements

培養細胞（牛腎臓由来株化MDBK細胞）で50回上清継代したBVDV/END(-)ウイルスは回収済みであるが、単純継代しただけでは、ウイルス遺伝子に変異が導入されない可能性を考慮し、宿主の自然免疫応答を強力に誘導するインターフェロン(IFN)を添加した状態でBVDV/END(-)の継代を実施した。その結果、継代10回を超えた時点で力価が安定し、25代目までウイルスの力価を落とすことなく維持出来た。この25代目のBVDV/END(-)をIFN耐性/P.25とし、次世代シーケンス解析を実施した。また、そのコントロールとして、BVDV/END(-)とは逆に、感染すると宿主の自然免疫応答を抑制するBVDV/END(+)もIFN存在下で同様に継代したが、このウイルスタイプはIFN耐性を獲得できないことが分かった。
MDBK細胞で50回継代したウイルス(P.50)とIFN耐性/P.25に導入された遺伝子変異を次世代シーケンサーで網羅的に解析した。その結果、P.50ウイルスには顕著に変異遺伝子の割合が増加している部位が7箇所見つかり、アミノ酸変異を伴うものは3箇所あった。IFN耐性/P.25にも、遺伝子変異が3箇所、アミノ酸変異を伴うものが1箇所見つかった。
本研究で見つかった変異の中でも特にアミノ酸配列の変化を伴う遺伝子変異について、既報の有無を確認したが、いずれの変異箇所においても自然免疫応答との関連は報告されていなかった。従って、本研究で発見した変異の中で、変異遺伝子が挿入されている割合が80%を超えている箇所を優先的に解析することにした。
リバースジェネティクス技術で変異ウイルスを作出する作業と並行して、ウイルスクローニング技術によって、変異ウイルスを回収することも併せて行っている。変異ウイルスが回収でき次第、その性状を自然免疫誘導能に着目して解析する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

BVDV/END(-)が容易にIFN耐性を獲得する能力を有したことによって、IFN耐性/P.25を予想よりも早く回収することが出来た。次世代シーケンス解析で得られた遺伝子変異も複数認められたが、全遺伝子に対する変異遺伝子の割合や既報の有無などの情報から、解析する変異部位を少数選抜することができたため、優先順位がつけやすく、効率よく実験を進められると考えている。平成29年度内に変異ウイルスの作出及び性状解析までを実施する予定であったが、変異箇所を選抜済みであることや、リバースジェネティクス技術だけでなく、ウイルスクローニング（逆プラック法）技術も併せて変異ウイルスの回収に着手できているため、平成30年度早々には変異ウイルスを回収できると見込んでいる。
また、ウシの自然免疫反応を高感度に検出できるレポーターシステムをすでに構築済みであること等も考慮すると、総合的に判断して本研究課題はおおむね順調に進展していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

早急に変異ウイルスの作出または回収を済ませ、得られた変異ウイルスの性状を詳細に解析する。まずは、生物性状をEND法や干渉法を用いて明らかにする。次いで、感染細胞に対する自然免疫誘導能を、本研究課題で構築したレポーターアッセイや、リアルタイムPCR法、IFNバイオアッセイ等を用いて調べ、親ウイルスの性状と比較・解析する予定である。
また、P.50もIFN耐性/P.25も自然免疫誘導能が大きく変化していない可能性も残されている。すなわち、BVDV/END(-)は、宿主の自然免疫応答や、自身の感染によって誘導された自然免疫反応と協調してウイルスの増殖を維持できるメカニズムを有していると考えることもできる。いずれの変異ウイルスも自然免疫誘導能が大きく変化していない場合には、ウイルス感染によって誘導される自然免疫反応だけでなく、ウイルスの増殖動態に与える影響なども詳細に確認し、認められた遺伝子変異が何に働いているのかも調査する予定である。

Causes of Carryover

平成30年度に購入予定のシングルルミノメーターを、平成29年度に購入する予定に変更した。そのため、平成30年度の予算から100万円を前倒して申請し、約94万円の機器を購入した。そのため、約6万円程度が当初の計画よりも多く配分された。次年度使用額である153,010円の内訳にはこの6万円が含まれている。また、次世代シーケンス解析を共同研究で実施したため、予定よりも低い金額で解析を行うことができた。それにより発生した余剰金も含まれている。当初の研究計画を変更し、平成30年度に変異ウイルスの作出を実施することにした。そのため、ウイルスの遺伝子操作にかかわる試薬の購入が当初の計画よりも増えることが予想されたため、平成29年度に生じた次年度使用額をこれら試薬の購入に充てる予定である。