2017 Fiscal Year Research-status Report
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16K18809
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Research Institution | National Agriculture and Food Research Organization |
Principal Investigator |
井関 博 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 動物衛生研究部門, 主任研究員 (90548207)
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Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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Keywords | Eimeria / コクシジウム / 伝染性ファブリキウス嚢病 / IBD / ワクチン / 鶏 / 原虫 / 寄生虫 |
Outline of Annual Research Achievements |
初年度はEimeria tenellaに伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのVP2遺伝子と蛍光蛋白質であるGFP遺伝子を導入したトランスジェニックE. tenellaの作製に成功した。この遺伝子組換え体は野生株と混ざった状態で鶏の糞に排出されるため、その中から遺伝子組換え体のみを選別するため、本年度は糞から回収した原虫を精製し、鶏に経口摂取するとともに、薬剤耐性遺伝子による選択をかけるために鶏に薬剤を飲ませた。得られた糞から原虫を精製し、外来遺伝子を標的としたPCRを実施したところ、特異的な増幅産物が確認されなかったことから、薬剤選択の効果が十分に発揮されず、野生株が増殖してしまった可能性が示唆された。一回目に得られた原虫をフローサイトメトリーを用いてGFPの蛍光を発する原虫のみを選別しようと試みたが、原虫の表面の自家蛍光が強く、選別することができなかった。鶏での選別は投与薬剤の濃度を上げると外来遺伝子の有無に関わらず原虫が死滅してしまうことが予想されるため、鶏を用いたin vivoにおける遺伝子組換え体の選抜を中断し、牛腎臓由来株化細胞(MDBK)を用いたin vitroにおける選抜を試みた。E. tenellaは限定的にしか培養細胞に感染しないことが報告されているため、培養条件や原虫の接種量等を検討し、培養細胞によるE. tenellaの遺伝子組換え体の選抜手法を確立した。次年度は本手法を用いて遺伝子組換え体をクローニングし、鶏で増幅させた後に免疫賦与の実験に用いる予定である。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成29年度までに遺伝子組換え体のクローニングを終了している予定であったため、やや遅れている。遅れている原因は、当初予想していたよりもトキソプラズマの遺伝子発現プロモーターのEimeria tenellaにおける発現効率が低く、in vivoの薬剤選択やGFPによる蛍光の選択ができなかったことによる。これらの問題をクリアするために、i vitroにおける遺伝子組換え体の選択を効果的に実施して、遅れを取り戻したい。
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Strategy for Future Research Activity |
クローニングした遺伝子組換え体を鶏に経口接種し、2 ヶ月間1 週間毎に採取した血液中の抗VP2 抗体を間接蛍光抗体法あるいは市販ELISA キットにより測定する。市販ワクチンを5 羽に接種した対照群を用意し、候補株接種群におけるVP2 抗体産生量の結果を比較検証する。次に伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスに対する感染防御試験を実施する。1 株につき10 羽の鶏に遺伝子組み換え原虫を経口接種し、接種28 日後にウイルスで攻撃する。市販鶏コクシジウム生ワクチン接種後にウイルスによる攻撃を実施する対照群を用意し、攻撃から7 日目に安楽殺を実施して剖検所見を得る。臨床症状と病理所見のスコア、血中ウイルス遺伝子量から効果を判定する。
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Causes of Carryover |
(理由) 研究資材が当初見積もりより安価に購入できたため (使用計画) 次年度の消耗品に使用
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