2017 Fiscal Year Annual Research Report
Easi-CRISPR for creating genetically modified mice using long ssDNA.
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16K18821
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| Research Institution | Tokai University |
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Principal Investigator |
三浦 浩美 東海大学, 医学部, 特定研究員 (90599523)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | レポーターノックインマウス / コンディショナルノックアウトマウス / 一本鎖DNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、独自のivTRT法で長鎖一本鎖DNAを合成し、それを用いて複数種類のノックインマウス(レポーター遺伝子挿入マウス、及びflox配列挿入によるコンディショナルノックアウトマウス[CKO])の作製、及びそれらマウスの解析を行った。
2017年度は主に、作製したマウスの解析(共同研究者らが行う)と、確立した新手法（Easi-CRISPR法）の標準化プロトコルの作成を行なった。作製したマウスの解析に関しては、以下１）-３）の結果が得られている。１）Mmp9レポーターノックインマウスに四塩化炭素( CCl4)を反復投与することで線維肝を誘導し、レポーター遺伝子発現の確認を行った。その結果、レポーター発現陽性細胞を顕微鏡下で確認することができた。またFACS解析においても、血球細胞のMmp9陽性細胞と考えられる細胞分画中に、蛍光遺伝子を発現する細胞集団を見出すことができた(共同研究者の稲垣豊教授、柳川亨世研究員ら)。２）iRFPノックインマウスの解析に関しては、IVISを用いた条件検討を行い、実際に生きたままのマウス肝臓での蛍光検出に成功している。３）作製した複数種類のCKOマウスのうち、Ambra1コンディショナルノックアウトマウスに関して解析を行った。CD4-Creマウスとの交配により得られた仔において、一部の血球細胞でflox配列が除去されていることが確認できた(共同研究者の佐藤健人准教授ら)。現在も引き続き共同研究者らによって機能解析が進められている。
更に本年度は、本研究計画の最終年度であるため、学術誌への投稿(2報)を行い、研究論文としてGenome Biology誌に、確立した手法のプロトコル論文としてNature Protocol誌にて発表することができた。
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[Journal Article] Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins2017
Author(s)
Quadros RM., Miura H., Harms DW., Akatsuka H., Sato T., Aida T., Redder R., Richardson GP., Inagaki Y., Sakai D., Buckley SM., Seshacharyulu P., Batra SK., Behlke MA., Zeiner SA., Jacobi AM., Izu Y., Thoreson WB., Urness LD., Mansour SL.*, Ohtsuka M.* and Gurumurthy CB.
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Journal Title
Genome Biology
Volume: 18
Pages: 92
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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