2016 Fiscal Year Research-status Report
アルギニンメチル化酵素PRMT5による心不全発症機構の解析と薬物治療への応用
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16K18876
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| Research Institution | University of Shizuoka |
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Principal Investigator |
刀坂 泰史 静岡県立大学, 薬学部, 講師 (00583973)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | PRMT5 / p300 / 心肥大 / 心不全 / GATA4 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
心疾患は我が国における死亡原因の上位であり、この問題の克服は重要である。これまでに、p300/GATA4転写経路が心肥大から心不全発症に至る遺伝子発現調節に極めて重要であることを示した。さらに申請者は新規GATA4結合分子としてアルギニンメチル化酵素PRMT5とその活性制御因子MEP50を同定し、病的心肥大に促進的に働くことを明らかにした。しかし、その作用分子機構と生体での心肥大及び心不全発症における役割は不明である。そこで本研究では、心肥大及び心不全発症におけるPRMT5/MEP50複合体によるp300/GATA4転写経路調節機構を明らかにすることを目的とした。平成28年度の研究実施計画として、(1) p300メチル化部位の同定及び (2) 心臓特異的PRMT5ノックアウトマウスでの検討とした。
(1)p300のアルギニン残基の変異体を作成し、in vitro methylation assayを行った結果、R200がメチル化標的部位であることを明らかにした。検討した他のアルギニン残基に関してはメチル化の関与は認められなかった。R200の変異体遺伝子を作成し、過剰発現までは確認できている。今後はこの細胞と遺伝子を用いて解析を進めていく。
(2)心臓特異的PRMT5ノックアウトマウスを作成した。心臓特異的なノックアウトをウエスタンブロットにて確認し、現在は実験に必要な数を確保するためにマウス交配中である。現在までにヘテロノックアウトマウスでの解析を進めているが、野生型マウスと同様に成長しており、少なくともヘテロのノックアウトではマウスの生存や心臓の成長には影響していないと考える。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
目的のいくつかについては達成できているが、マウスの実験が予定より遅れており、研究としてはやや遅れていると考える。研究目的 (1) については順調に進展しており、PRMT5によるp300のメチル化とその影響について明らかにできると確信している。研究目的 (2) についても順調に進展しているが、これまでに小規模サンプル数の解析しか行っておらず、一部の解析は進展しているが、まだ数が少なく、さらなる検討が必要である。マウス実験に時間がかかっている理由としては共同研究先へのマウス搬入手続きの際に微生物検査に問題があったため時間がかかってしまったこと、マウスの交配が予定より悪く、必要な数の確保ができていないためである。
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| Strategy for Future Research Activity |
申請書と特に大きな変更はない。
研究目的 (1) PRMT5-TGにおけるp300/GATA4転写活性
PRMT5によってメチル化されるアルギニン残基を同定し、遺伝子合成までは行っている。p300変異体を用いて、GATA4依存的転写反応への影響を検討する。PRMT5は野生型p300によって誘導されるGATA4の転写活性を抑制する。そこで変異型p300によって誘導されるGATA4の転写活性に対するPRMT5の抑制効果についてレポーターアッセイやクロマチン免疫沈降法などで検討する。
研究目的 (2) 動物レベルにおけるPRMT5の心肥大・心不全発症における機能解析
ノックアウトマウスが確保できしだい、大動脈結紮手術 (TAC) により圧負荷モデルを作成し、心肥大への影響を心臓/体重比、組織染色、定量PCR、WB法により調べる。TACモデルにおける心臓機能の変化を心臓超音波検査にて検討するのに加え、同様に生化学的・組織学的な解析も行う。マウスの交配自体は可能であることがわかっており、次年度以降の計画には影響しないと考える。
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