2016 Fiscal Year Research-status Report
必須微量栄養素セレンの脳への移行および脳特異的保持メカニズムの解明
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16K18921
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
吉田 さくら 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(薬学系), 助教 (40736419)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | セレン / 神経細胞 / 微量元素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は，必須微量栄養素セレンの脳への輸送および脳特異的保持機構の解明を目的とし，セレン結合タンパクの探索および神経細胞のセレン利用能に関する検討を行なった。セレンは抗酸化因子として生体内，特に脳において重要であり，これまでにアルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患と脳内セレン濃度やセレン含有酵素グルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)との関連も報告されている。脳特有のセレン代謝メカニズムには未解明な点が多く残されており，脳や神経細胞におけるセレン代謝経路の解明は，これらの神経変性疾患などの発症機構の解明，予防法開発の一助になると考えられる。
ラットから摘出した脊髄後根神経節（DRG）細胞を培養し，合成したペニシラミンセレノトリスルフィド(PenSSeSPen)を培地に添加して一定時間培養後，細胞質のグルタチオンペルオキシダーゼ活性およびセレン量を測定した。培地にPenSSeSPenを添加48時間後にGPx活性が上昇したことから，PenSSeSPen由来セレンが神経細胞内に取り込まれ，セレンタンパクの合成に利用されたと推察された。また，fluorescamineを用いてPenSSeSPenの蛍光標識体を合成し，緩衝液や培地中での安定性を検討した結果，pH 7.4の緩衝液中でも24時間以上蛍光スペクトルに大きな変化が見られず一定期間安定に存在することが分かった。DRG細胞にfluorescamine標識PenSSeSPenを添加し，12時間後に蛍光顕微鏡で観察すると，微弱ながら細胞内にfluorescamine由来の蛍光が観察され，DRG細胞内に取り込まれていることが示唆された。さらに，ラット脳細胞質溶液を，限外ろ過により精製した試料を用いてセレン結合タンパク質を探索した結果，これまでとは異なるピークが検出されたことから，複数の結合タンパクが存在する可能性がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
DRG細胞においては，天然のセレン化合物である亜セレン酸やセレノメチオニン(SeMet)が細胞内に取り込まれ，GPx活性上昇に寄与していることを報告しているが，今回用いたPenSSeSPenはこれらの化合物よりも低い濃度で同等の効果を示すという新たな知見が得られた。セレンの生体利用効率は，化学形により異なることが知られているが，今回使用したPenSSeSPenは活性代謝物として検出されているグルタチオンセレノトリスルフィドのモデル化合物であることから，高い利用効率が示されたと考えられた。蛍光標識したPenSSeSPenは，蛍光色素の種類，細胞への添加時間や濃度について今後検討が必要であるものの，セレンの神経細胞への移行を観察するために利用できると考えられる。脳細胞質溶液由来セレン結合タンパクについては，これまでにCystatin-12 precursorを報告しているが，限外ろ過により精製した試料を分析した結果，これまでとは異なるピークが検出されたことから，複数のセレン結合性タンパクが存在する可能性が示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 脳細胞質由来セレン結合タンパクの探索：脳細胞質溶液を，界面活性剤等を用いてさらに分離精製し，質量分析法によりセレン結合タンパクの探索を行う。また，膜タンパクの抽出についても検討する。
2. 脊髄後根神経節(DRG)細胞のセレン利用能評価：PenSSeSPenの利用能について，さらに種々の培養条件を設定して検討する。また，脳細胞質から検出されたセレン結合タンパクがDRG細胞でも発現しているかどうかをwestern blotting等により確認し，さらにセレン結合タンパクの機能阻害によりセレンの細胞内への取り込みや保持への影響が見られるかどうかを検討する。
3. 蛍光プローブを用いた脊髄後根神経節(DRG)細胞へのセレンの取り込み評価：ヒト血清アルブミン(HSA)とPenSSeSPen複合体の蛍光標識体を作成し，DRG細胞に添加して培養後，顕微鏡観察および蛍光色素の分布を調べることにより，セレンの細胞内取り込み過程に関する情報を得る予定である。研究に用いる蛍光色素については，種々の標識体を合成し，培地での安定性などを考慮してより適したものを選択する。
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| Causes of Carryover |
試薬や消耗品の価格変動や研究の進行状況により，残高が発生した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度の試薬や消耗品購入に使用を予定している。
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