突然変異誘発過程におけるPP2Aリン酸化の役割とその機序

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K18927
• Research Institution: National Institute of Health Sciences
• Principal Investigator: 石井 雄二 国立医薬品食品衛生研究所, 病理部, 主任研究官 (70544881)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: PP2A

Outline of Annual Research Achievements

これまでにフェニルプロぺノイド化合物（PPCs）の一つであるエストラゴール（ES）の突然変異誘発に、DNA付加体の形成に加えて細胞増殖活性が寄与することを明らかにしてきた。本研究ではESの細胞増殖活性機序を明らかにすることを目的とし、平成28年度はESに加え、PPCsのうち遺伝毒性を有するメチルオイゲノール（MEG）と、非遺伝毒性物質であるオイゲノール（EG）を用いて、細胞増殖活性の構造活性相関とその機序を検索した。雄性6週齢のF344ラットにES、MEG及びEGをそれぞれ300、100及び300 mg/kgの用量で28日間強制経口投与後、肝臓を採取した。肝臓における病理組織学検索の結果、遺伝毒性を有するES及びMEG投与群では肝細胞のアポトーシス像と核分裂像が散見された。一方、EG投与群においても肝細胞の核分裂像が認められたことから、細胞周期のS期に発現するPCNAの免疫組織化学染色法による検出を行った結果、PCNA陽性細胞は対照群に比していずれのPPCs投与群においても増加が認められた。リアルタイムRT-PCRにより細胞周期関連因子（Ccne1、Ccnb1及びCcna2）の遺伝子発現解析を行った結果、ES投与群ではいずれも有意な上昇が認められたものの、他のPPCs投与群において顕著な変化は認められなかった。ウエスタンブロット法によるタンパク質発現解析の結果、PPCs投与群ではPP2A及びErkのリン酸化タンパクの発現が増加することを明らかにした。これらの結果から、PPCsは遺伝毒性の有無に関わらず、PP2Aのリン酸化を介した細胞増殖活性作用を有する可能性が示唆された。また、抽出したDNAを用いてDNAマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を実施した結果、EG、MEG、ES投与群で共通して発現が上昇する39の遺伝子と、低下する32の遺伝子を明らかにした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成28年度は、ES、MEG、EGを用いて細胞増殖活性がPPCsの骨格に共通した作用である可能性を見出した。また、これら3剤の投与によってラット肝臓で変動する計71の遺伝子の存在を明らかにした。これらの実験はいずれも当初の研究計画通り進行した。現在、網羅的遺伝子発現解析で認められた71の遺伝子からPP2Aリン酸化に関連する遺伝子の精査を行っている。これについては当初の予定よりも若干の遅れがみられるが、平成29年度に実施予定の実験と並行して実施できることから、当初の研究計画にある実施内容に変更の必要はない。

Strategy for Future Research Activity

平成28年度に実施した網羅的遺伝子発現解析の結果から、PPCsに共通して変動した71の遺伝子（増加39、減少32）からPP2Aのリン酸化に関連する遺伝子を抽出する。それらについてリアルタイムRT-PCRによる半定量解析を実施する。また、それらの遺伝子の発現に寄与する分子についても遺伝子又はタンパク質発現解析を実施し、そのシグナル経路を検討する。さらに、平成29年度はPP2Aを不活性化する化学物質を用いて、PP2Aの不活性化が遺伝毒性物質の突然変異誘発性に及ぼす影響を検討する。PP2A不活性剤にはミクロシスチンを用いてその用量設定試験を実施する。F344ラットにミクロシスチンを10、20又は40 mg/kgの用量で週3回腹腔内投与し、2週間後肝臓を採取する。肝臓における病理組織学的検索と免疫組織化学染色法によるPCNAの検出を行うことで、細胞増殖活性が上昇するミクロシスチンの用量を明らかにする。本試験では、F344系gpt deltaラットにミクロシスチンとES又はその他の遺伝毒性物質と28日間併用投与する。肝臓における病理組織学的検索及びin vivo変異原性の検索により、PP2A不活性化によって生じる細胞増殖が遺伝毒性物質の突然変異誘発性に及ぼす影響を評価する。

Causes of Carryover

平成28年度に購入する予定であった一部の実験用の試薬及び消耗品について、解析結果に基づいて段階的に購入する必要があることから、次年度に購入することとしたため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

実験用の試薬及び消耗品の購入費に充てる。