2016 Fiscal Year Research-status Report
HLAの関与する特異体質薬物毒性発症のin vitro予測を志向した基盤研究
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16K18932
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
青木 重樹 千葉大学, 大学院薬学研究院, 助教 (30728366)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | HLA / 特異体質 / 薬物毒性 / ペプチドレパートリー変化 / ファージディスプレイ / ドッキングシミュレーション |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでに、HLA遺伝子を導入したHeLa細胞を用いた検討から、HLA-B*57:01特異的にアバカビルの結合が認められることをLC-MS/MSを用いて確認しており、それが当該多型保有による特異体質毒性惹起に関連しているものと考えている。
28年度は、HLAに薬物が結合した際に、実際に提示されるペプチドのレパートリーが変化することを確認した。具体的には、HLAを導入したHeLa細胞に薬物を曝露し、酸性バッファーによって表面タンパク質・薬物を溶出させた後に、そこに含まれる9～11アミノ酸からなるペプチドをLC-MSを用いて測定した。この結果から、被験薬物を曝露したHLA導入細胞を利用することによって、29年度以降に予定しているペプチドレパートリー変化を検出可能なファージディスプレイスクリーニングの系を構築できるものと考えている。
また、コンピュータを用いたin silicoドッキングシミュレーション法によって、HLA-B*57:01とアバカビルの静的な結合を再現できること、さらにアバカビルと類似の構造を有する化合物では結合が認められないことを示した。特に、HLAと薬物の相互作用を検出するにあたっては、HLAのペプチド結合領域全体に対してシミュレーションを行うのではなく、ペプチド結合領域に存在する溝ごとに行うことが望ましく、さらに結合パターンについてクラスター解析を行うことで、特異的な結合を見出せるものと考えている。
以上より、HLAに提示されたペプチドレパートリー変化（異常抗原）のスクリーニング系、さらにはスクリーニングの適切性を確認するin silico評価系の基盤構築が行えたものと考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
29年度からはファージディスプレイ法を用いて、HLAに対する抗原提示変化を評価する方法論の構築に着手するが、28年度にそのベースができたものと考えている。また、抗体ファージライブラリを購入し、培養法・振盪条件を工夫することで、安定的に増幅・精製することが可能となった。以上より、研究は計画的かつ順調に進展しているものと判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
29年度以降に、HLAに薬物が結合した際に生じるペプチドレパートリー変化をファージディスプレイ法を用いて検出するための方法論を構築する。通常、ファージディスプレイは標的となる抗原に特異的に結合する抗体をスクリーニングする方法として用いられるが、その概念を応用して、ペプチドレパートリー変化を間接的にモニターすることが可能となるのではないかと考えている。具体的には、ネガティブセレクション、ポジティブセレクションのサイクルを繰り返し、HLA-薬物複合体に結合する特異的なファージクローンが取得されるか否かで評価する。スクリーニングは、HLAを発現させた細胞そのもの、またはHLA複合体をアフィニティ精製して固相化したビーズを用いてスクリーニングを行う。
可能であれば、同スクリーニングをHLA導入マウス由来の初代培養細胞で試みること、網羅的なスクリーニング系への発展を将来的に見据えたスクリーニング系のダウンスケールに向けた取り組みも行う。
in silicoシミュレーションについては、静的なドッキングシミュレーションのみではなく、動的な分子動力学（MD）計算も行うことで、より適切な結合親和性の予測を可能とする方法論の構築を試みる。
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| Causes of Carryover |
当初はHLAを導入したマウスより採取した初代培養細胞を用いて、HLAに被験薬物が曝露された際の異常抗原提示の確認や毒性の発現を再現する予定であった。しかし、予備的検討から、当培養手法は煩雑である等の課題があることが分かり、ファージディスプレイの系を構築する際に汎用することは適切ではないと判断した。さらに、培養細胞を用いた系からもペプチドレパートリーの変化を見出すことはできたことから、こちらを用いてスクリーニング評価系の妥当性を明らかとすることが建設的であるものと思われる。以上のことから、当初予定していたHLA導入マウスの繁殖・維持や初代培養細胞の採取・培養等を本年度行わなかったため、使用額が当初予定額より低くなった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ファージディスプレイの系の構築と併せて、HLA導入マウス由来の初代培養細胞を用いて系の妥当性を検証する予定である。そのため、29年度には、当初予定していなかった、HLA導入マウスの繁殖・維持や初代培養細胞の採取・培養等に費用がかかるため、28年度に充当することを予定していた予算を充てるものとする。
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Research Products
(1 results)
