2017 Fiscal Year Research-status Report
抗がん薬の苦味による臓器特異的なP-gpの機能亢進メカニズムと抑制方法の探索
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16K18956
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| Research Institution | Takasaki University of Health and Welfare |
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Principal Investigator |
矢野 健太郎 高崎健康福祉大学, 薬学部, 助教 (40644290)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | P-gp / 苦味 / 細胞膜上局在 / 消化管ホルモン / 足場タンパク |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでに、小腸上皮細胞に存在する苦味受容体が苦味物質を感知すると、9時間後に排出系トランスポーターのひとつであるP-糖タンパク (P-gp)の発現量が増加することが報告されている。本年度は、苦味物質を感知してから即座にP-gpの機能が亢進する別のメカニズムが存在するのではないかと考え、臨床で用いられる抗がん薬を用いて検討を行なった。まず、ヒト結腸がん由来細胞Caco-2細胞に、苦味受容体が発現していることを確認し、このCaco-2細胞に苦味物質であるフェニルチオカルバミド(PTC)を暴露したところ、90分後にP-gpの基質薬物であるrhodamine 123 (Rho123)の細胞内蓄積低下と掃き出し増加が確認され、P-gpの機能亢進が認められた。さらに、PTC刺激によって分泌される消化管ホルモンであるコレシストキニン (CCK)の受容体の発現がCaco-2細胞において確認されたことから、CCKを暴露したところ30分後に同様の機能亢進が認められた。これに対して、CCK阻害薬を前処理した後にPTCを処理すると、P-gpの機能亢進が消失した。加えて、Caco-2細胞にCCKを暴露するとP-gpの総発現量は変化しないものの細胞膜上における発現量の顕著な上昇が認められ、このときにP-gpの膜上発現を支える足場タンパクの細胞膜上での発現が増加していた。これらのことから、PTCによるP-gpの即時的な機能亢進には、CCK受容体の刺激を介したP-gpの膜上発現を亢進させるシグナルが関与していることが示唆された(J Pharm Sci., 106(9), 2650-2656 (2017))。一方、苦味を有する抗がん薬の曝露によっても即時的にP-gpの機能が亢進することを確認しており、これに足場タンパクの活性化を介したP-gpの細胞膜上の発現量の増加が関与していることを想定している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
29年度は、抗がん薬の苦味による即時的なP-gp機能調節とそのメカニズムを明らかにするため、①抗がん薬によるP-gpの輸送機能変化、②抗がん薬によるP-gpの局在とERMの活性の変化を明らかにすることを検討計画とした。まず昨年度までの続きとして、苦味受容体や消化管ホルモンの分泌細胞としての性質をCaco-2細胞が有しているのかを確認するとともに、その受容体を直接刺激する物質がP-gpの機能を即時的に亢進し得るか否かについて検討した。Caco-2細胞において、苦味受容体のひとつであるT2R38および、消化管ホルモンのひとつであるCCKを感知する受容体であるCCK-R、それぞれが発現していることを確認した。さらに、PTC暴露90分後にP-gpの輸送機能が亢進しており、T2R38刺激後に分泌されるCCKを直接暴露したときには、僅か30分後にP-gpの輸送機能が亢進していた。一方、PTC刺激によるP-gpの機能亢進は、CCK-Rの阻害剤によって消失した。したがって、P-gpの機能亢進は、僅か数十分の苦味刺激およびその下流因子であるCCKの暴露によって、即時的に引き起こされることが確認され①の目的は概ね達成した。また、そのメカニズムのひとつとしてP-gpの細胞膜上発現量の増加とP-gpの細胞膜上発現を支える足場タンパクが細胞膜上で増加していることを明らかにし②の目的も達成できた。現在、これまでに我々が抗がん薬の中でも強い苦味を有していることを報告しているエトポシドを用いて、同様の現象が認められるかの検討に着手しており、P-gpの輸送機能がPTC同様に数十分で亢進することを確認している。このことから、エトポシドによるP-gpの即時的な機能亢進にも苦味刺激が関与しているものと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画どおり、薬物の苦味刺激によるP-gpの機能亢進メカニズムの解明を目的として、抗がん薬エトポシドによるP-gpの機能亢進に苦味受容体 (T2R38) が関与するかについて検討する。29年度までに、Caco-2細胞にエトポシドを添加して数十分後には、P-gpの輸送機能が亢進することを確認している。本年度では、この機能亢進のメカニズムを明らかにするため、①苦味受容体の遺伝子発現をsmall interfering RNA (siRNA) あるいはclustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins (CRISPR-cas9)により抑制し、エトポシドによるP-gpの機能亢進が阻害されるかを確認する。併せて、CCK受容体の阻害による影響も検討する。②細胞膜を抽出し、細胞膜画分におけるP-gpおよび活性化型の足場タンパクの発現量変化を確認する。③足場タンパクの活性化シグナル因子の同定を行なう。シグナル分子に関しては、足場タンパクの活性化に関わるras homolog gene family, member A (RhoA)などに着目し、これらのタンパク質発現量および活性化 (リン酸化) 状態を確認する。さらに、それらの阻害薬(ロスバスタチンやファスジル)による影響を評価する。加えて、マウスにエトポシドを経口投与し、P-gp基質の動態が即時的に変化するかを検討することで、臨床への応用性を示す。30年度末までには、抗がん薬の苦味によってもP-gpの輸送機能が亢進することに加え、そのメカニズムとして「リン酸化シグナルによって足場タンパクが活性化され、細胞膜上におけるP-gpの発現量が増加する」ことを示すことができるものと考えられる。
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