2017 Fiscal Year Annual Research Report
Analysis of the unique voltage-dependent mechanism of a Na+ channel by voltage-clamp fluorometry
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16K19000
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| Research Institution | National Institute for Physiological Sciences |
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Principal Investigator |
下村 拓史 生理学研究所, 分子細胞生理研究領域, 助教 (50635464)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | イオンチャネル / ホスホイノシチド / 膜電位存性Na+チャネル / 電気生理学 / Two-Pore channel |
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| Outline of Annual Research Achievements |
電位センサードメイン（VSD）を同一分子中に2つ持つTwo-pore Na+ channel（TPC）について、特にTPCファミリー3（TPC3）を対象にして研究を行った。前年度までに、(1) 蛍光性システイン修飾試薬を用いて膜電位固定下化学蛍光測定を行い、リピートⅡのVSDは膜電位依存的な構造変化を起こすこと、(2) TPC3がある種のホスホイノシチド（PI）による制御を受けること、を示唆する結果を得た。本年度はこれらの2点の方向についてそれぞれ研究を行った。
(1) 前年度までに同定した、修飾性蛍光試薬ラベルにより蛍光変化を確認できるシステイン導入位置に、蛍光性非天然アミノ酸（fUAA）を導入し電流測定を試みた。しかしながら、当該残基へfUAAを導入したTPC3変異体では電流を確認できなかった。そこで、近傍の残基に網羅的にfUAAを導入した変異体を作製して電流測定を行ったところ、電流を測定できる変異体を同定することができた。現在の発現量ではこのfUAA変異体から有意な蛍光変化を得ることはできていないので、発現量を増加させる、より大きな蛍光変化を生じる残基を探索するなどの、さらなる最適化が必要と考えられる。
(2) リピートⅠがPI結合に重要であることを示唆する結果が得られていたため、その結合部位を詳細に解析した。リピートⅠのS4/S5リンカーとS6ヘリックスには、正の荷電残基が多数存在しており、この領域が負電荷を持つPIの結合に重要ではないかと想定された。これらの残基を中性化した変異体を解析したところ、PI存在下で観察されるTPC3の電位依存性の変化が消失した。この結果は、変異導入によりPIに対する親和性が低下したことを示唆しており、TPC3においてはPIがリピートⅠのS4/S5リンカーおよびS6領域に結合することで電位依存性が変化することが考えられる。
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