2017 Fiscal Year Research-status Report
細胞極性タンパクaPKCによる乳腺組織幹細胞の増殖分化制御機構の解析
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16K19041
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
佐々木 和教 横浜市立大学, 医学部, 助教 (50438131)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | シグナル伝達 / 発生・分化 / 細胞・組織 / 細胞極性 / がん / 幹前駆細胞 / 乳腺 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、マウス乳腺上皮組織を幹細胞解析系のモデルとし、細胞極性タンパクaPKC (atypical protein kinase C)が乳腺幹及び前駆細胞の増殖や分化をどのように調節するかを解明することである。昨年度までに、マウス乳腺初代培養細胞のポピュレーションからFACSで幹細胞分画を取得し、ノックダウンや阻害剤による機能破壊を行った実験から、aPKCが乳腺幹細胞の機能に関与する結果を得ていた。この到達点を踏まえ、本年度は分子メカニズムの一端を明らかにすることを目的とした。そこで、本年度はaPKCによる幹細胞関連因子のリン酸化に着眼し、詳細な解析を行った。その結果、(1)リコンビナントタンパク質を用いたin vitroキナーゼアッセイから、aPKCが幹細胞関連因子を直接リン酸化すること、(2)培養細胞を用いたウエスタンブロット解析から、aPKCが幹細胞関連因子をin vivoでリン酸化すること、(3)低分子量GTPaseがaPKCを活性化して幹細胞関連因子のリン酸化を誘導する上流因子として働くこと、を見出した。さらに、このリン酸化は、幹細胞関連因子による遺伝子発現調節に関与することを見出した。これらの結果は、aPKCが幹細胞関連因子を直接リン酸化することで、乳腺組織幹細胞の機能に関与する可能性を示す。aPKCによる幹細胞関連因子のリン酸化がどのように乳腺組織幹細胞に関係するかを調べるため、幹細胞関連因子の野生型と変異体を用いた機能解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度までに、マウス乳腺初代培養細胞を用いた解析から、aPKCが乳腺幹細胞の機能に関与する結果を得た。今年度は、この制御の分子メカニズムに迫るために、aPKCのキナーゼターゲットの解析に注力した。その結果、aPKCがある幹細胞関連因子を直接リン酸化することを見出し、さらに、リン酸化を受けるアミノ酸残基も特定した。これらの結果は、aPKCがどのようなメカニズムで乳腺幹細胞の機能に関与するかの一端を明らかにしたものである。以上より、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、aPKCによる幹細胞関連因子のリン酸化がどのように乳腺組織幹細胞に関係するかを調べる。このために、幹細胞関連因子の野生型と変異体を用いた機能解析を進める。さらに、aPKCと幹細胞関連因子がどのように乳腺幹細胞機能を制御するか、その分子メカニズムの全体像に迫るために、aPKCと幹細胞関連因子によって発現制御を受ける共通の遺伝子群を特定する。このために、aPKC及び幹細胞関連因子の遺伝子改変をおこなった乳腺オルガノイドやマンモスフィアを用いて、マイクロアレイ解析を行う。バイオインフォマティクス解析を行い、幹細胞シグネチュアやどのようなシグナル系の変動と相関関係にあるかを明らかにする。また、aPKC及び幹細胞関連因子の遺伝子改変をおこなった乳腺初代培養細胞をマウス乳腺の脂肪体へ移植し、乳腺の再構築を見る実験により、in vivoにおける幹細胞機能に関与するかどうかを検証する。
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| Causes of Carryover |
本研究では、乳腺初代培養細胞をin vitroで培養し、乳腺幹細胞の機能解析を行う。このために、まず複数のFVB/Njcl系統マウスを購入し、コラゲナーゼなどの初代培養調整試薬を用いて乳腺初代培養を取得する。次に、微量な乳腺幹細胞分画をセルソーターで分取し、マトリゲル内や専用の液体培地で培養する。本年度は、１回の実験に使用するマウスの数および培養試薬の使用量が当初の想定よりも少なかった。また、幹細胞関連因子に対するリン酸化抗体を独自に作製することを計画していたが、市販抗体でも十分実験に使用可能であることが分かった。次年度はaPKCと幹細胞関連因子が発現調節を行う共通した遺伝子群をマイクロアレイで同定するとともに、移植による乳腺の再構築実験と免疫組織化学による解析を行う。その費用に充てる分を計上した。
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