2017 Fiscal Year Annual Research Report
Comprehensive cell lineage analysis of epicardial progenitor cells
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16K19042
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
阿部 高也 国立研究開発法人理化学研究所, ライフサイエンス技術基盤研究センター, 研究員 (10720609)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ゲノムバーコーディング / 心臓前駆細胞 / 細胞系譜解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
800文字
本計画では心臓前駆細胞の一つである心外膜前駆細胞の網羅的細胞系譜により、その由来となる細胞集団の解明を目指した。そのため、CRISPR/Cas9システムによりマウスゲノムへ様々な変異を引き起こし、そのゲノム変異を個々の細胞を認識するID(バーコード)として標識する網羅的細胞系譜解析法を考案した。しかし、本研究課題採択後にゼブラフィシュにおいて、同様な手法を用いた報告がなされた(McKenna et al., 2016)。そこで変異を導入するために必要なgRNAおよびバーコードのもとになる10種類のgRNA標的配列(アレイ配列)はその報告を参考にして以下に示す遺伝子改変マウスの作製を試みた。1)誘導型Cas9発現マウス、2)gRNA発現アレイマウスv1(ribozime)、3) gRNA発現アレイマウスv2(恒常発現U6プロモーター)(2016成果報告参照)。さらに、遺伝子改変マウスの作製期間を短縮するためゲノム編集技術を用いて受精卵においてノックインマウスの樹立を行い1)と2)のマウスを作製した。3)のマウスはゲノム編集技術では作製が不可能なため(アレイがバーコード化される)ES細胞を用いたgene targetingにより作製を行った。受精卵を使うことで作製期間が短縮され1)と2)のマウスが先行して樹立され、実際に恒常的にCas9を働かせてバーコート化を行い、バーコードの塩基配列の解析を行った。その結果、変異(バーコード化)が確認されたが、10種類のアレイ配列のうち一部の標的部位のみであった。RibozimeによるgRNAの発現が十分ではない可能性が考えられた。今後さらに評価を進め行く。一方、3)のマウスについては目的の相同組換え体ES細胞が得られ、キメラマウスを作出することができた。今後、F1マウスを樹立してバーコード化の効率について検討を行う。
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