2018 Fiscal Year Research-status Report
ヘッジホッグ関連因子STILによる浸潤突起を介した膵臓癌浸潤機構の解明
| Project/Area Number |
16K19091
|
|---|
| Research Institution | Aichi Medical University |
|---|
Principal Investigator |
伊藤 秀明 愛知医科大学, 医学部, 助教 (90711276)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | 膵臓癌 / 浸潤突起 / ソニックヘッジホッグ / 細胞骨格 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
膵臓癌をはじめとする多くの癌細胞では、浸潤突起 (invadopodia)と呼ばれる構造体を形成し細胞外マトリックスを破壊し浸潤すると考えられている。しかし、浸潤突起の形成機構は大部分が明らかなっていない。
申請者は膵臓癌で発現が上昇しているヘッジホッグ関連因子であるSTIL（SIL, SCL/TAL1 interrupting locus）に対する特異的siRNAにより浸潤突起が消失するという予備的知見を得ており、本課題では浸潤突起形成におけるSTILの分子機能について分子細胞生物学及び病理組織学的手法によりに解明し、以てSTILを介した膵臓癌浸潤機構の解明ならびに膵臓癌新規治療標的の基盤的知見の確立を目指している。
これまでの浸潤突起形成過程におけるSTILの局在の経時的解析により、STILは浸潤突起の形成初期に起こるとされる骨格形成に関与していると考えられる知見が得られた。そのため、浸潤突起骨格形成に関連する因子とSTILとの関係について検討を行い、STILノックダウン細胞ではアクチン結合タンパク質Cortactinのリン酸化物（Y421)が減少していることを見出した。
さらに、Proxymity ligation assay(PLA法）により、浸潤突起におけるSTILとCortactinの複合体形成を膵臓癌培養細胞で確認した。膵臓癌病理組織においても、PLA法を施行し、STILとCortactinの複合体シグナルを確認した。
以上よりSTILはCortactinを介し浸潤突起形成に関与していると考えられ、今後STILとCortactinリン酸化の関係について解析を進めたいと考えている。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
STILは浸潤突起の骨格が形成される段階に関与していると考えられる知見が得られたため、細胞底面の浸潤突起骨格形成に関連する因子とSTILとの関係について検討を行った。具体的には蛍光免疫細胞染色やウエスタンブロッティングにより、浸潤突起関連因子（Src, Integrin Beta-1, Pyk2, FAK, Cortactin等）の分布や発現量について、STILノックダウン細胞とコントロール細胞で比較を行った。その結果、STILノックダウン細胞ではリン酸化Cortactin（Y421)が減少していることを見出した。
in situでSTILとCortactinの複合体形成を確認するため、膵臓癌培養細胞でPLA法を施行し、浸潤突起形成部におけるSTILとCortactinの複合体形成シグナルを確認した。さらに膵臓癌病理組織においても、PLA法を施行し、STILとCortactinのシグナルを確認した。
また、本研究ではこれまで膵臓癌培養細胞Panc-1を使用してきたが、BxPC-3などPanc-1以外の膵臓癌培養細胞でもSTILノックダウンにより浸潤突起が減少することを確認した。さらに乳癌培養細胞MDA-MB-231でも、同様の現象を確認した。
研究は進展しているものの、Cortactinは当初STILと共同して浸潤突起形成に関与していると予想した分子とは異なり、その検索に時間を要した。そのため研究はやや遅れていると判断した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、①STILがCortactinのリン酸化をどのようにして制御しているかを明らかにすること及び②病理組織における検討を予定している。
①ではCortactinやそのリン酸化に関わる分子（Src, Arg）及びSTILとの結合を、タグ付きタンパク質を用いた免疫沈降法やPLA法により解析することを予定している。
②では、膵臓癌外科病理検体（パラフィン包埋切片）を多数症例用い、PLA法により非癌部と前癌病変部、浸潤癌部でSTILとCortactinの結合を検討することを予定している。
|
| Causes of Carryover |
当初STILは浸潤突起成熟期に関与していると予想していたが、経時的な検討により浸潤突起形成初期の骨格形成に関与していると考えられたため、STILと共同して浸潤突起形成に働くと考えられる関連因子をより広い範囲で検索した。そのため時間を要し、本年度分の予算を全額使用することができなかった。
本年度にSTILノックダウン細胞ではリン酸化Cortactinが減少しているという知見を得たため、次年度はCortactinのリン酸化に関与する因子とSTILとの免疫沈降法による結合解析、PLA法によるin situでの複合体形成の解析等の分子生物学的実験、および病理組織切片上での検討を計画しており、これら実験のため本助成金を使用する予定としている。
|
