2016 Fiscal Year Research-status Report
The molecular function of TMEPAI in tumorigenesis
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16K19100
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
渡邊 幸秀 筑波大学, 医学医療系, 助教 (40618534)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 腫瘍形成 / がん関連遺伝子 / 生体内機能解析 / TMEPAI |
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| Outline of Annual Research Achievements |
TMEPAI(Transmembrane androgen induced-protein)はがん細胞で発現が亢進している膜タンパク質で、TMEPAIをノックダウンしたがん細胞では皮下移植腫瘍形成能が著しく低下することから、TMEPAIは新規のがん関連タンパク質と考えられている。また、申請者等はTMEPAIがTGF-betaシグナルの負のフィードバック制御に関わることを明らかにしている。さらにTMEPAIはTGF-bシグナルのみならず、アンドロゲンシグナルやPI3K/AKTシグナルにも関与するという報告があり、TMEPAIがどのように腫瘍形成に関与するか詳細な検討が必要である。
申請者等は、まずがん細胞におけるTMEPAIの発現アイソフォームについて検討した。TMEPAIはヒトでは細胞外ドメインの異なる4つのアイソフォームが存在するため、がん細胞および正常細胞において発現するアイソフォームに違いが認められた場合、がんの診断や標的になり得る可能性がある。
さらに、申請者等はCRISPR/Cas9システムを用いて、TMEPAIをノックアウトした乳がん細胞を樹立し、内在性TMEPAIの機能を解析することや、ノックアウト細胞にTMEPAIの各機能ドメインを欠損した変異体を再発現させることによって、腫瘍形成能やがん細胞の増殖、浸潤、遊走等におけるTMEPAIの機能解析を行っている。また、各アイソフォームを再発現した細胞株も作製し、アイソフォームによる作用の違いについても検討する。
申請者等は既にTMEPAIのノックアウトを作製しており、生体内におけるTMEPAIの機能を解析し、さらにTMEPAIマウスと発がんモデルマウスや化学発癌実験を行い、TMEPAIの腫瘍における役割を明らかにすることを目指している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
TMEPAIのアイソフォームの同定について、5’-RACE法やウエスタンブロットにより解析を行った。乳がん細胞においてはアイソフォームDの発現が強い傾向があり、正常乳腺上皮細胞株ではアイソフォームBの発現が認められた。しかしながら、アイソフォームBとDはタンパク質がほぼ同じであることから、ウエスタンブロットでの解析が行えず、現在各アイソフォームに特異的な抗体を作製している。
乳がん細胞において、TMEPAIをノックアウトした細胞を樹立し、in vitroスフェア形成試験やコロニー形成試験、浸潤試験を行ったところ、TMEPAIをノックアウトするとスフェア形成能、コロニー形成能、浸潤能が低下することを認めた。今後、in vivoでの腫瘍形成試験等を開始する予定であるが、がんの増大、進展、転移等を非侵襲的にモニターするためにLuciferaseを発現する細胞株を準備している。さらに、TMEPAIの腫瘍形成メカニズムを明らかにするため、TMEPAIの各ドメイン欠損変異体を再発現して、in vitroおよびin vivoにより腫瘍形成能を検討する予定である。
TMEPAIの生体内での機能を解析するために、ノックアウトマウスを生化学的、病理学的に解析しているが、現在までに顕著な表現型は認められていない。TMEPAIのファミリー分子であるC18orf1ノックアウトマウスも作製し、ダブルノックアウトマウスも作製しているが、同様に表現型は認められていない。今後、これらのマウスに脂肪食の投与や発がんモデルマウスとの交配、化学発癌実験等を行い表現型を確認する。
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| Strategy for Future Research Activity |
TMEPAIのアイソフォーム解析については、現在、各アイソフォームの細胞外ドメインに対する抗体を作製中である。しかし、TMEPAIの細胞外ドメインはアイソフォームAで約30アミノ酸、アイソフォームB、Dでは10アミノ酸程と短く、さらに糖鎖修飾部位を含んでいるため、抗体が反応しづらい可能性があるが、糖鎖修飾の切断や阻害を行い検討する。細胞外ドメインに対する抗体が得られた場合、病理組織標本等を染色し、がんにおけるTMEPAIの発現解析や予後との相関を検討する。
TMEPAIの機能に関しては、現在、新たな機能としてTMEPAIがWntシグナルの抑制にも関与することを見出しており、詳細なメカニズム解析を行う。がん細胞においてTMEPAIがどのように関与するか、腫瘍形成試験、浸潤試験等の従来の機能試験に加え、がん幹細胞の可視化等の実験方法の確立にも着手しており、これらの実験方法により検討する予定である。
TMEPAIおよびC18orf1ノックアウトマウスの表現型については、通常飼育下では目立った変化は認められていない。TMEPAIは腫瘍や炎症等の特殊な条件下でより発現が高まることが知られており、実験的にそれらを惹起することで表現型が認められる可能性がある。今後、マウスの発がん試験や、ブレオマイシン誘導肺線維症等の実験によりTMEPAIの生体における機能を解析する予定である。
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[Journal Article] The protein kinase LKB1 negatively regulates bone morphogenetic protein receptor signaling.2016
Author(s)
Raja E, Tzavlaki K, Vuilleumier R, Edlund K, Kahata K, Zieba A, Moren A, Watanabe Y, Voytruk I, Botling J, Soderberg O, Micke P, Pyrowolakis G, Heldin C-H, Moustakas A
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Journal Title
Oncotarget
Volume: 7
Pages: 1120-1143
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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