2016 Fiscal Year Research-status Report
エクソソーム情報伝播を制御する病原性大腸菌分泌因子の解析
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16K19126
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
顔 宏哲 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (50612066)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 病原性大腸菌 / 腸管出血性大腸菌 / エフェクター / エクソソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、病原性大腸菌による宿主細胞のエクソソーム形成と分泌を制御する病原因子の探索とその分子メカニズムを明らかにすることを目的としている。
H28年度の計画目標は、EPEC のエフェクター病原性因子を網羅的解析し、エクソソームの分泌に影響する分子を明らかにする。具体的に、
(1)EPEC のエフェクター 遺伝子が欠失している TOE-A 菌株を貪食細胞THP-1 に感染させ、 培養液中に放出されたエクソソームを超遠心法またはPEG沈殿法で濃縮し、WB でエクソソームマーカー (CD63,syntenin) の変動を半定量的に評価した。その結果、(a) 従来炎症抑制に関わると知られている NleE をはじめ、複数の候補エフェクターが関与していることを明らかにした。(b) 同定された因子の中に、エクソソームの分泌を促進、または、抑制するものがあることが明らかとなった。この事から、EPEC はエフェクターを介して、宿主 エクソソーム機構を繊細に調節していることを示唆している。
(2)病原菌感染によって炎症性エクソソームが放出される報告とEPECは宿主炎症応答を積極的に抑制することから、次に抑制に関わるエフェクター候補に焦点を当て、エクソソーム分泌に対する抑制能力を相補株で確認した。WB でエクソソームマーカーの変動を半定量的に評価した。その結果、欠失しているTOE-A 菌株に比べて、相補株はエクソソームマーカー (CD63, syntenin) が減少したことを確認できた。この結果より、着目したエフェクターによるエクソソーム分泌抑制効果を確定することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H28年度の目標として、宿主細胞のエクソソーム分泌に影響しうる病原因子（エフェクター）の同定は概ね達成した。分泌に対して抑制と促進する因子が存在していることが明らかとなった。現段階、相補株による検証実験において、抑制エフェクタータンパク質の検証を先行に行い、確定できた。促進に関与する候補因子の検証について、引き続き相補株を作成して上記の手法で確定を行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
H29年度の計画として、抑制機能を示すエフェクターを先行に以下の解析を進める。
(1)エフェクターによるエクソソーム分泌形成経路の作用点を明らかにする。具体的に、野生株 EPEC、抑制エフェクターの単独knockout(KO)株、及び、相補株を細胞に感染し、エクソソーム形成経路のどの段階にエフェクターが局在しているかを調べ、各段階の形態と個数を免疫染色法で評価する。
(2)抑制エフェクターの機能ドメインを明らかにする。具体的に、異なる長さのアミノ酸部位を欠損したエフェクター発現菌株を作成し、細胞感染を行う。その際に、(a)エクソソームマーカーのWBによる、分泌量の評価する、と (b) 免疫染色法による細胞内のエクソソーム形成構造物の形態と個数の変動を全長のエフェクターの場合と比較して明らかにする。
(3)宿主の標的因子を同定する。エクソソームの形成に直接または間接的に作用することで、形成および分泌に影響すると考えられる。したがって、THP-1 細胞の細胞抽出液と精製したタグ付きの全長、または、機能部位が欠失したエフェクタータンパク質と混合して、全長のみに特異的に共沈殿する宿主タンパク質を質量分析法で同定する。また、上記(1)で、エクソソーム形成異常が認められたステージがある場合、その形成ステージに関わる分子を認識抗体で、共沈殿物中にかの分子はあるかをWB 法で検出することで、エフェクターが作用する宿主因子を明らかにする。
(4)エフェクターを含むエクソソームの機能解析。予備実験で特定のエフェクターはエクソソームに内包していることがわかっている。このエクソソームは細胞に取り組まれたのち、細胞機能にどのような影響をもたらすかを明らかにする。具体的に、精製したエクソソームを細胞に投与したのち、免疫反応、増殖能、 運動性の変化を検討する。
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| Causes of Carryover |
H28年度の計画において、エクソソーム産生を影響する EPEC エフェクター分子の網羅的解析を行った。その結果、複数の候補分子を見出すことができた。候補因子の中に、抑制または促進の効果をもつものがあるから、抑制能を示す候補に絞り、確定するための解析実験を行うことにした。それによって、促進の候補エフェクターの確定実験に必要な支出が次年度の使用額となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
前年度より繰り越した金額は、エクソソームの分泌に対して促進作用をもつ候補エフェクターの確定解析実験に使用することを予定している。
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