2016 Fiscal Year Research-status Report
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16K19127
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| Research Institution | Gifu Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
高橋 圭太 岐阜薬科大学, 薬学部, 助教 (50634929)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 乳酸菌 / 粘膜ワクチン / パイエル板 / アジュバント / DNAワクチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
経口的に抗原を接種する経口ワクチンは、全身性免疫に加えて注射型ワクチンでは誘導が難しい腸管における粘膜免疫を誘導できることから注目されている。本研究では、乳酸菌をベクターとして用いる経口ワクチン系の開発を行う。
平成28年度には、以下の1-4を行った。
1.黄色ブドウ球菌由来ヌクレアーゼをモデル抗原として発現する乳酸菌をマウスに経口接種することで、抗原特異的な全身性免疫および粘膜免疫を誘導できることを明らかにした。続いて、ヒトの病原細菌である腸管出血性大腸菌O-157と同様の感染様式を示すマウスの病原細菌であるCitrobacter rodentium（C. rodentium）の腸管上皮細胞接着関連蛋白を発現する乳酸菌を作製した。この組換え乳酸菌の経口接種により、その後のC. rodentium攻撃感染が部分的に防御されることを明らかにした。
2.パイエル板指向性の乳酸菌への付加により抗原発現乳酸菌の免疫誘導能の増強が可能か検討するため、パイエル板指向性蛋白を発現する乳酸菌を作製し、そのパイエル板指向性をin vitroおよびマウス小腸を用いた解析にて評価した。
3.抗原蛋白と同時に免疫賦活効果を有するアジュバントを発現する乳酸菌を構築し、抗原発現乳酸菌の免疫誘導の増強もしくは制御が可能か検討するため、T細胞分化に関わるサイトカインIL-12、TLR5リガンドであるグラム陰性菌鞭毛タンパクFliCを発現する乳酸菌を作製した。
4.哺乳類細胞でルシフェラーゼを発現するプラスミドを保持する乳酸菌をマウスに経口接種することにより、小腸の細胞でルシフェラーゼの発現が起こることを確認した。本研究成果は現在論文投稿中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成28年度は以下の1-4の項目の実施を計画しており、全ての項目で概ね予定していた成果を得た。
1.抗原蛋白発現乳酸菌のマウスへの経口接種による免疫誘導条件の確立：黄色ブドウ球菌ヌクレアーゼをモデル抗原として発現する乳酸菌を用い、経口接種を3日間連続で2週間毎に3回（計9回）行うことで、抗原特異的免疫応答の誘導が可能であることを明らかにした。また、マウス系統によって抗原発現乳酸菌による免疫誘導に顕著な差がみられることを明らかにした。続いて、ヒトの病原細菌である腸管出血性大腸菌O-157と同様の感染様式を示すマウスの病原細菌であるC. rodentiumの腸管上皮細胞接着関連蛋白（EspB、Tir）を発現する乳酸菌を作製し、これらの蛋白が乳酸菌で産生されることを確認した。これらの組換え乳酸菌の経口接種により、その後のC. rodentium感染が部分的に防御されることを明らかにした。
2.パイエル板指向性乳酸菌の作製：M細胞の表面に発現する糖蛋白であるGP2と結合することが知られているFimH（大腸菌等の一型線毛蛋白）を発現する乳酸菌および補体受容体C5aRと結合することが知られているOmpH（エルシニア菌の外膜蛋白）を発現する乳酸菌を作製した。作製した組換え乳酸菌のパイエル板への指向性について検討中である。
3.アジュバント蛋白発現乳酸菌の作製：アジュバント蛋白として当初計画していたIL-12を発現する乳酸菌に加え、鞭毛蛋白FliCを発現する乳酸菌を作製した。計画では乳酸菌が産生したアジュバント蛋白のin vitroでの活性評価を行う予定であったが進んでいない。
4.乳酸菌をベクターとして用いて抗原蛋白発現プラスミドを腸管の細胞に輸送できるか検討：プラスミドを保持する乳酸菌の経口接種により、小腸の細胞にプラスミドの輸送が可能であることを明らかにした（論文投稿中）。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究成果を踏まえ、今後は以下の1-4の項目に記載した内容の検討を進める。
1.これまでの検討から、乳酸菌の抗原蛋白の産生量が免疫誘導に影響することが示唆された。そこで、乳酸菌のコドン使用頻度に合わせて、抗原遺伝子の最適化を行うことにより抗原発現量の増大が可能か、抗原発現量の増大が免疫誘導能および感染防御能の増強につながるか検討する。
2.パイエル板指向性乳酸菌の免疫誘導能の評価：平成28年度に作製したパイエル板指向性乳酸菌の免疫誘導能を親株乳酸菌と比較し、パイエル板指向性の付与によって免疫誘導能が向上するか検討する。
3.アジュバント蛋白発現乳酸菌の免疫誘導能の評価：平成28年度に作製したアジュバント蛋白発現乳酸菌に加え、さらにいくつかの種類のアジュバント蛋白（腸管における免疫に重要な役割を果たすことが知られているサイトカインTSLPおよびB細胞の活性化を誘導するサイトカインBAFF・APRILを予定）を発現する乳酸菌を作製し、それらの免疫誘導能の評価および誘導する免疫のタイプ（例；Th1、Th2、Th17等）の解析を行う。
4.乳酸菌による抗原蛋白発現プラスミド輸送による免疫誘導：平成28年度に、乳酸菌を用いて小腸の細胞にDNAを輸送することが可能であることを明らかにした。今後は、乳酸菌がDNAを輸送する相手の細胞種の特定に加え、乳酸菌による抗原DNAの輸送によって抗原特異的な免疫応答の誘導が可能かを明らかにする。
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| Causes of Carryover |
平成28年度に細菌学会（仙台）にて発表を予定していたが、実験が遅れたために発表できなかった。そのため、未使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成28年度にアジュバント蛋白の生物学的機能についてのin vitroでの解析を予定していたが、この実験まで進まなかったため、本実験を次年度に行うこととし、未使用額はその経費に充てることとしたい。
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Research Products
(4 results)
