2016 Fiscal Year Research-status Report
腸管上皮細胞への指向性を誘起する緑膿菌の感知機構の解析
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16K19129
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| Research Institution | Kyoto Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
林 直樹 京都薬科大学, 薬学部, 助教 (70707463)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 緑膿菌 / 上皮細胞 / ムチン層 / 鞭毛運動 / 感知 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
臨床上重要な日和見感染症起因菌であるPseudomonas aeruginosa (緑膿菌) は免疫力の低下した宿主の上皮を越えて血液中に移行（トランスロケーション）し、重篤な血液感染症を引き起こすことがある。我々は緑膿菌トランスロケーションの過程を、（１）上皮細胞の感知、（２）上皮細胞への接近、（３）上皮細胞への付着、（４）上皮細胞層透過経路の形成、（５）上皮細胞間隙透過に分けて解析してきた。本研究では、緑膿菌の腸管腔からのトランスロケーション機構を明らかにすることで、宿主環境に応じた細菌の感染メカニズムに基づく新たな予防および治療法考案のためのターゲットバリデーションを行なう。具体的には、緑膿菌トランスロケーションにおける「腸管上皮細胞の感知」にターゲットを絞り、（１）緑膿菌が感知する腸管上皮細胞培養上清成分の同定、（２）緑膿菌が腸管上皮細胞を感知する機構の解明、（３）腸管上皮細胞が緑膿菌のムチン層透過を亢進する機構の解明を目指す。
申請時までに申請者は、ヒト結腸癌由来Caco-2細胞培養上清に含まれる10 kDa以下の成分が、緑膿菌によるムチン層透過を亢進することを見出していた。平成２８年度は、この結果をもとに緑膿菌が感知する腸管上皮細胞培養上清に含まれる成分の同定を目指して解析を進めた。その結果、緑膿菌によるムチン層透過を亢進するCaco-2細胞培養上清成分の特徴として、（１）3-10 kDa以下のサイズであること、（２）タンパク質であること、（３）培養10日目以降のCaco-2細胞が分泌すること、（４）複数種類の成分が含まれること、（５）亢進する成分の一つがケモカインであること、をそれぞれ見出した。平成２９年度は、培養15日目のCaco-2細胞培養上清中に含まれる３つの特異的なバンドの同定ならびに緑膿菌が腸管上皮細胞を感知する機構の解明を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請時までに申請者は、ヒト結腸癌由来Caco-2細胞培養上清に含まれる10kDa以下の成分が、緑膿菌のムチン層透過を亢進することを見出していた。平成２８年度は、この結果をもとに、緑膿菌が感知する腸管上皮細胞培養上清中の物質を単離・同定することを目指し、概ね計画通りに研究を進めることができた。
平成２８年度に得られた結果を列挙すると、（１）緑膿菌が感知するCaco-2細胞培養上清の成分は、DNA、RNA、糖鎖、およびタンパク質のうち、タンパク質であること、（２）緑膿菌が感知する成分は、培養15日目以降のCaco-2細胞培養上清に含まれること、（３）培養15日目のCaco-2細胞培養上清中には、培養5日目ではみられない10 kDa以下のサイズに３つの特異的なバンドがみられること、（４）培養15日目のCaco-2細胞培養上清中には５つのケモカインが含まれ、このうちの１つが緑膿菌によるムチン層透過をCaco-2細胞培養上清と比べて70％亢進することである。これらの結果から、緑膿菌は上皮細胞が分泌するケモカインを含む複数種類の10 kDa以下のタンパク質を感知し、ムチン層を透過することが示唆された。また平成２８年度の解析において、ケモカインの一種が本菌によるムチン層透過を亢進することを見出せたことは、Caco-2細胞培養上清により亢進する緑膿菌メカニズムの解析を進めいていくうえで有用な情報となる成果であり、平成２９年度以降の計画も予定通り進めることができると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２８度までの成果から、緑膿菌は腸管上皮細胞が分泌するケモカインを含む複数種類の10 kDa以下のタンパク質を感知し、ムチン層を透過することが示唆された。平成２９年度は申請時の計画通り、Caco-2細胞培養上清により亢進する緑膿菌メカニズムの解析を進める。緑膿菌は鞭毛運動とムチン分解との少なくとも２つの機能を協力的に作用させることでムチン層を透過することを、申請者らのグループは論文で公表している。また、平成２８年度の研究過程において申請者は、Caco-2細胞培養上清が緑膿菌の増殖速度やプロテアーゼ活性に影響することなく、鞭毛依存性のswarming運動を亢進することを見出している。そこで平成２９年度は、Caco-2細胞培養上清がswarming運動を亢進するメカニズムの解明を目指し、平成２８年度に同定したケモカインによる（１）緑膿菌の鞭毛フィラメント回転速度への影響、および（２）緑膿菌によるケモカインへの化学走化性を解析する。これらメカニズムを解析後、緑膿菌が腸管上皮細胞を感知するセンサーの同定を進める計画である。また、これら申請時の計画に加え、培養15日目のCaco-2細胞培養上清中に含まれる３つの特異的なバンドを解析することで、緑膿菌が感知する腸管上皮細胞培養上清成分の同定を引き続き目指す。
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