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2017 Fiscal Year Annual Research Report

Functional analysis of host factor participating in replication mechanism of the hepatitis E virus genome RNA

Research Project

Project/Area Number 16K19144
Research InstitutionJichi Medical University

Principal Investigator

小林 富成  自治医科大学, 医学部, 助教 (00634164)

Project Period (FY) 2016-04-01 – 2018-03-31
KeywordsHEV / レプリコン / RNA複製 / 細胞培養 / リバースジェネティクス法 / PSAP
Outline of Annual Research Achievements

本研究では、細胞内におけるHEVゲノムRNAの複製機構を明らかとするために、従来のリバースジェネティクス法で用いるcDNA由来の全長RNAだけではなく、細胞内でゲノムRNAのみが複製するHEVレプリコンの構築を検討した。さらに、全長のゲノムRNAからORF2の領域に、レポーター遺伝子を組み込こんだHEVレプリコンを構築した。試験管内で合成したレプリコンRNAをPLC/PRF/5細胞に導入し、レプリコンRNAの増殖を解析したが、レポーター蛋白質(eGFP)を検出することができなかった。そこで、レポーター蛋白質をより蛍光強度が強いAcGFPやmOrangeに変更し、蛍光発色を解析したが、レポーター蛋白質を検出することができなかった。しかし、細胞内のレプリコンRNAの増殖をノーザンブロッティング法で解析すると、複製中間体であるdsRNAを検出することができ、ゲノムRNAの複製産物であるsubgenomic RNAから翻訳されるORF3蛋白質も同様の発現効率であることが示された。この結果、レポーター蛋白質の蛍光発色を検出するまでの効率はないものの、細胞内でレプリコンRNAを複製させることができ、ゲノムRNAの複製機構を解析することが可能であることが示唆された。
また、ヒトHEVのORF3にはPSAPモチーフといわれるウイルス粒子の放出に重要なアミノ酸配列が存在するが、ラットHEVにはPSAPモチーフは存在していなかった。そこでラットHEVのORF3のプロリンリッチの領域に着目し、93、96、98番目のプロリンをそれぞれロイシンに置換し、ラットHEVの増殖効率を解析した。93、96番目のプロリンを置換した変異体はウイルスの増殖効率が1/100-1,000に減少し、ウイルスが細胞から放出される際に付加される細胞由来の膜成分も減少していた。このことから、93、96番目のプロリンはウイルスの放出に関与していることが明らかとなった。

  • Research Products

    (4 results)

All 2018 2017

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results) Presentation (1 results)

  • [Journal Article] An analysis of two open reading frames (ORF3 and ORF4) of rat hepatitis E virus genome using its infectious cDNA clones with mutations in ORF3 or ORF42018

    • Author(s)
      Tanggis、Kobayashi Tominari、Takahashi Masaharu、Jirintai Suljid、Nishizawa Tsutomu、Nagashima Shigeo、Nishiyama Takashi、Kunita Satoshi、Hayama Emiko、Tanaka Takeshi、Mulyanto、Okamoto Hiroaki
    • Journal Title

      Virus Research

      Volume: 249 Pages: 16~30

    • DOI

      10.1016/j.virusres.2018.02.014

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Full-length genome of a novel genotype 3 hepatitis E virus strain obtained from domestic pigs in Japan2017

    • Author(s)
      Primadharsini Putu Prathiwi、Miyake Masao、Kunita Satoshi、Nishizawa Tsutomu、Takahashi Masaharu、Nagashima Shigeo、Tanggis、Ohnishi Hiroshi、Kobayashi Tominari、Nishiyama Takashi、Jirintai Suljid、Okamoto Hiroaki
    • Journal Title

      Virus Research

      Volume: 240 Pages: 147~153

    • DOI

      10.1016/j.virusres.2017.08.003

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Characterization of the Quasi-Enveloped Hepatitis E Virus Particles Released by the Cellular Exosomal Pathway2017

    • Author(s)
      Nagashima Shigeo、Takahashi Masaharu、Kobayashi Tominari、Nishizawa Tsutomu、Nishiyama Takashi、Primadharsini Putu Prathiwi、Okamoto Hiroaki、Tanggis
    • Journal Title

      Journal of Virology

      Volume: 91 Pages: e00822~17

    • DOI

      10.1128/JVI.00822-17

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 感染培養系を用いたE型肝炎治療薬の検討2017

    • Author(s)
      小林 富成、西山 尚志、長嶋 茂雄、西澤 勉、高橋 雅春、唐 吉思、Putu Prathiwi Primadharsini、岡本 宏明
    • Organizer
      第65回 日本ウイルス学会学術集会

URL: 

Published: 2018-12-17  

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