2016 Fiscal Year Research-status Report
クローン病腸管線維化治療を目的としたHSP47の線維化機構の解明
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16K19150
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
本澤 有介 京都大学, 医学研究科, 医員 (90737884)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 炎症性腸疾患 / クローン病 / heat shock protein 47 / 腸管線維化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、クローン病(以下CD)の腸管線維化について、コラーゲン産生に必須の分子であるheat shock protein(以下HSP)47が炎症性サイトカインであるIL-17Aを介して亢進していることを報告してきた。しかしながら、HSP47を介した腸管線維化には他のサイトカインなども関与しているとされ、その詳細な機序解明については十分ではない。また、線維化治療を目指すためのHSP47制御についての検討も今後の課題である。この為、IL-17A以外にもHSP47に関与するサイトカイン及び経路について検討し、さらにマウスHSP47shRNAを作成し、その線維化の制御を試みた。結果、マウス線維芽細胞株(NIH3T3)に炎症性サイトカイン(TNF-α、IL-1β、IL-17A)、抗炎症性サイトカイン(TGF-β1、IL-10)による刺激を行ったところIL-17A以外にTGF-β1刺激にてHSP47及びコラーゲンの発現亢進を遺伝子(mRNA)、蛋白にて確認した。また、炎症性腸疾患(以下IBD)モデルマウスにおけるTGF-β1の関与を明らかにするためIL-10ノックアウト(以下KO)マウスの腸管組織でTGF-β1の発現を遺伝子(mRNA)にて確認したところ、炎症部位におけるTGF-β1が非炎症部位に比して発現が亢進していることを確認した。さらにNIH3T3においてIL-17A刺激ではその発現経路にJNK経路が関与し、TGF-β1刺激ではJNK以外にもsmad 2/3経路がHSP47、コラーゲン発現に関与していた。加えてNIH3T3にHSP47shRNA投与を行った状態でIL-17AおよびTGF-β1による刺激を加えた検討では、いずれもコラーゲンの発現が抑えられた。このことから、HSP47そのものの制御による腸管線維化治療の可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
IBDモデルマウスであるIL-10KOマウスにおける検討にて12週頃より自然腸炎を発症し、その腸管組織における免疫染色(Azan染色)にて線維化を確認し、同部位の遺伝子(mRNA)解析にてHSP47の発現亢進を認めた。また、NIH3T3にてIL-17AおよびTGF-β1刺激におけるHSP47、コラーゲンの発現亢進を認め、それぞれJNK、smad2/3経路が関与していることも確認した。さらに同細胞株においてHSP47shRNAによるコラーゲン発現抑制についても確認し、マウスにおけるHSP47の線維化の関与およびその制御の可能性についてある程度明らかにすることが可能であった。しかしながら、IL-10KOマウスの腸管組織より単離した腸管筋線維芽細胞の初代培養系における検討では、検体によるHSP47、コラーゲンの発現量の変化が大きく異なり、腸炎の程度を考慮して培養細胞の調整を行うのに時間を要したため、現時点でTGF-β1のみでしか解析ができなかった。また、HSP47のプロモーター領域にGFPを組み込んだレポーターアッセイ系についてもNIH3T3、腸管筋線維芽細胞の初代培養系いずれでも樹立しているが、腸管筋線維芽細胞の検討ではマウス間での培養状態の差が大きく、現在NIH3T3中心に解析を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
IL-10KOマウスにてHSP47が腸管線維化に関与している可能性が示唆されたことから、同様の検討をTCR-αKOマウスでも行う。IL-10KOマウスはヒトにおけるCD類似腸管病変を認め、TCR-αKOマウスは潰瘍性大腸炎(以下UC)類似腸管病変を認めるとされ、両者の差異について同様の検討を行うことで線維化に関与する機構に関してより詳細に行うことが可能と思われる。また、NIH3T3で行った解析手法を、IBDモデルマウス腸管組織より単離した腸管筋線維芽細胞の初代培養系にも用いることで、よりIBDの病態に近いモデルでの解析を行う。さらに我々がすでに確立しているヒト腸管組織より単離した腸管筋線維芽細胞の初代培養系の手法をヒトIBD腸管組織においても行うことでマウスと同様の解析が可能であるかを検討する。線維化制御についてはHSP47shRNAの作成がNIH3T3の検討で可能であったことより、IBDモデルマウスの腸炎部位にマウス専用内視鏡を用いてshRNAを投与することで線維化の抑制が可能であるかを蛋白及び病理学的に確認する。
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| Causes of Carryover |
本年度はマウス線維芽細胞株(NIH3T3)及びIL-10KOマウスの解析が主な研究内容となったが、本実験マウスは自然腸炎発症に12週程度かかるためマウスそのものを用いた実験の開始がマウス購入後しばらくの時間がかかり、IL-10KOの実験予定を一部細胞株の実験に変更した。また、実験マウス腸管組織より単離した腸管筋線維芽細胞のプロモーター領域のDNAメチル化の解析や同検体のマイクロアレイ解析のためのサンプル調整や解析費用が高価となり、予算内での経費配分変更を余儀なくされた。この為、実験マウスの解析に要する経費が本年度は一部軽減されたため次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度の研究遂行に必要とされる経費は1)実験マウスの飼育・管理、2)各種抗体および試薬、3)情報収集および成果発表のための旅費である。1) 実験マウスの飼育・管理：本年度は細胞株の検討からマウスより単離した細胞(腸管筋線維芽細胞の初代培養系)を用いた検討やマウス腸管線維化の治療実験など多めの実験マウスの維持管理が必要となる。2) 各種抗体および試薬：これまでと同様に病理学的解析やサイトカインの刺激実験に加えて本年度予定していた遺伝子解析に必要な試薬・抗体の購入が必要である。3) 情報収集および成果発表のための旅費：本研究に関する情報収集および成果発表のための旅費が必要になる。
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Research Products
(17 results)
