2016 Fiscal Year Research-status Report
可溶性エポキシド加水分解酵素(sEH)の糖尿病における機能と発現調節機構の解明
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16K19188
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| Research Institution | Kwansei Gakuin University |
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Principal Investigator |
大黒 亜美 関西学院大学, 理工学部, 助教 (20634497)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | エポキシド加水分解酵素 / 酸化ストレス / アラキドン酸 / DHA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
可溶性エポキシド加水分解酵素(sEH)は薬物代謝酵素として知られているが、生体内の不飽和脂肪酸の代謝において重要な酵素である。本研究ではsEH発現量が糖尿病において引き起こされる酸化ストレスによりどのように調節されているのか、またsEH発現の変化がその基質や代謝物の生理活性に与える影響を明らかにすることを目的としている。これまでsEHは酸化ストレスにより転写因子Sp1及びAp2αを介して負に転写制御されていることを明らかにしている。本年度では、これらの転写因子に加えてs EH遺伝子上流に結合配列が確認されているNF-κBに着目してその調節機構を検討した。NF-κB不活性化剤であるデキサメサゾンの細胞への添加やNF-κBの構成因子であるp65を過剰発現させてsEHのプロモーター活性をレポーターアッセイにより検討したところ、NF-κBはsEHの転写を負に制御していることを明らかにした。また様々な長さのsEH遺伝子上流域を用いることによりNF-κBによる転写抑制に重要な領域を明らかにした。またNF-κBのSp1との相互作用が検出されたことからNF-κBはSp1と協調して酸化ストレスによるsEHの転写抑制に関わっている可能性が考えられた。一方でsEHの基質としてアラキドン酸からチトクロームP450(P450)により産生されるエポキシエイコサトリエン酸(EET)が知られているが、本年度はアラキドン酸と同じく様々な生理活性を持つドコサヘキサエン酸(DHA)に着目した。精製した13種類のラットP450分子種を用いて再構成系にてDHAと反応させ、それぞれのP450により産生されるDHA水酸化体及びエポキシ体をLC-MSにより同定した。さらに産生されたDHAエポキシ体はsEHによりジオール体に変換されたことから、sEHはDHAの代謝系にも関与することが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究により、sEHの転写を負に制御する因子として新たにNF-κBの関与を明らかにできた。これまで、sEH発現量は糖尿病マウスの肝臓や腎臓、血管で減少することを明らかにしており、高グルコースによる酸化ストレスが原因であることを明らかにしている。NF-κBは酸化ストレスにより活性化することから、糖尿病におけるsEHの減少にNF-κBが関与している可能性が考えられる。一方で、本研究ではsEHがDHA代謝にも重要であることを明らかにするため、本年度ではP450によるDHA酸化体(水酸化体及びエポキシ体)を同定し、P450分子種それぞれの活性特異性を明らかにすることができた。よってそれぞれのP450分子種の臓器における発現パターンに沿って産生されるDHA酸化体も異なると予想される。さらにそのエポキシ体はsEHにより代謝されたことから、sEHはDHA酸化体の量やその生理活性を調節している可能性が考えられた。DHAの生体内酸化体の生理機能はまだ未解明な部分が多く、今後明らかにしていきたいと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
高グルコースに起因する酸化ストレスによるsEH転写抑制については、NF-κBとSp1の関わりに着目してその詳しいメカニズムを検討する。sEHは生体内においてアラキドン酸のみならずDHAの酸化体量も制御していることが考えられた。アラキドン酸の酸化体が様々な生理活性を持つように、DHAにおいても生体内で産生される酸化体が生体内で重要な生理活性を持つことが予想される。そこで29年度はアラキドン酸に加えてDHAの水酸化体及びエポキシ体の生理活性を明らかにし、さらにsEHがそれらの作用に及ぼす影響について明らかにする。すでに培養細胞を用いた実験によりDHA酸化体の生理活性を見出しており、それらをもとにラットまたはマウス用いて疾患の病態にDHA酸化体が及ぼす影響を検討する予定である。また変化が見られた疾患モデル動物においてsEH及びP450の発現量や活性の変化を検討する。DHAの摂取は生活習慣病の予防や脳機能の増進に有効でるとされている。そこで線虫を用いてDHA及びその酸化体の寿命への影響を検討する。また糖尿病のモデルとして線虫のグルコース過剰摂取は寿命を短縮することが報告されており、我々の実験においても確認できている。そこでこのモデルにおいてもアラキドン酸やDHA、その酸化体の影響を検討する。
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| Causes of Carryover |
必要な試薬類を購入し、端数が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度の試薬類購入に充てる。
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