2016 Fiscal Year Research-status Report
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16K19324
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
中井 正人 北海道大学, 大学病院, 助教 (40756003)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | DNAセンサー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
種々の肝細胞株（HuH1、HuH6、HuH7およびその派生細胞、HLE、HLF）およびHEK293などからtotal RNAを抽出し、RT-PCRを行いcDNA合成を行った後、定量PCR法にて各種DNAセンサー分子（DDX41、MAVS、STING、cGUS、DAIなど）の発現を評価した。
また、感染実験に用いるためのHBVウイルスを作成した。HepG2.2.15.7細胞株を継代し、その上清を回収し、フィルトレーション後、23％NACLおよび50%PEG8000使用した沈殿法にてウイルス濃縮液を作成した。作成したウイルスを、HBV感染許容細胞株であるNTCP-HepG2-C4細胞へ感染実験を行い、14日間継代し細胞を回収、HBV-DNAおよびRNAを定量PCRにて測定することで、HBV感染が行われていることを確認した。また、当初平成29年度に施行する予定であった、恒常的なDNAセンサー分子をノックダウンした細胞株の作成の予備実験としてDDX41に対するshRNAを含むレンチウイルスを作成し、レンチウイルスのタイトレーションチェックを行った後、HepG2およびNTCP-HepG2-C4細胞株に感染し、恒常的DDX41ノックダウン細胞株を作成した。同細胞株における、DDX41の発現レベルが低下していることを定量PCR法にて確認し、継代して細胞株を樹立した。同細胞株に対して、HBV感染実験を施行した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
予備実験による恒常的ノックアウト細胞の作製に時間を要したため、平成28年度中に予定していた後述の実験の進行が遅くなっている。
「HepG2もしくはHuh7細胞へHBVプラスミドを強制発現した後に発現が増強もしくは抑制される自然免疫に関わる分子（とくにDNAセンサー）に関して、Gene chipなどのマイクロアレイ解析を用いて免疫関連分子を中心に網羅的に検索を行い、候補分子の抽出を行う実験」は進行中である。そのため、結果を踏まえて行う予定であった、「肝細胞株(HepG2、HuH7)において、肝細胞に発現している各種DNAセンサーをコードするプラスミドを強制発現もしくはsiRNAを用いてknock downした後、HBV発現プラスミドをトランスフェクションし、レポーターアッセイを用いてTypeⅠおよびTypeⅢ IFN発現を評価する実験及び上清中のケモカイン・サイトカイン産生をELISA法、CBA assay評価する実験」が未施行であるため。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、平成28年度に施行予定であったが進行中または未到達の下記の実験を行う。
①HepG2もしくはHuh7細胞へHBVプラスミドを強制発現した後に発現が増強もしくは抑制される自然免疫に関わる分子（とくにDNAセンサー）に関して、Gene chipなどのマイクロアレイ解析を用いて免疫関連分子を中心に網羅的に検索を行い、候補分子の抽出を行う。
②既知のDNAセンサーとして機能するパターン認識レセプター（特にDDX41）に関して、HBV-DNA認識に関わるか否か、その場合の免疫応答とHBV遺伝子、蛋白の変動について検討する
また、その実験と並行し、予備実験にて施行していた恒常的なDNAセンサー分子のノックアウト細胞、恒常発現細胞株の樹立を目指す。
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| Causes of Carryover |
当初よりも実験計画が遅れており、使用物品購入のタイミングが遅れたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
実験計画の進行に応じて、必要な物品購入を行う。
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