2019 Fiscal Year Annual Research Report
Research for innate immune system sensor molecules in HBV infection
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16K19324
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
中井 正人 北海道大学, 大学病院, 助教 (40756003)
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2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | DNAセンサー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
種々の肝細胞株各種肝細胞株（HepG2,HepG2.2.15.7,HuH1,HuH6.5,HuH7.5,HLE,HLF）およびHEK293からcDNA合成を行い、定量PCR法にて各種DNAセンサー分子（DDX41、MAVS、STING、cGUS、DAIなど）の発現を評価した。（特に、DNAセンサー分子としてDDX41分子に着目し、この発現の多寡を定量PCR法にて確認した。）コントロールと比較して、各肝細胞（HepG2,HepG2.2.15.7,HuH1,HuH6.5,HuH7.5,HLE,HLF）においてDDX41の発現は有意に高く、特にHepG2.2.15.7細胞では多い結果であった。HepG2.2.15.7細胞、HepAD38.7細胞の上清から作成した感染実験用のHBVウイルス濃縮液を用いて、HBV感染許容細胞株であるNTCP-HepG2-C4細胞株へ感染実験を行い、HBV-DNAおよびHBV-RNAを定量PCRで測定し感染性を確認した。また、恒常的なDNAセンサー分子をノックダウンした細胞株として、DDX41に対するshRNAを含むレンチウイルスを作成し、HepG2細胞株およびNTCP-HepG2-C4細胞株に対して感染させ、恒常的なDDX41ノックダウン細胞株を作成した。上記HBVウイルスを用いて感染実験を行うと、DDX41の恒常的ノックアウトNTCP-C4-HepG2細胞においては、非ノックアウトNTCP-C4-HepG2細胞と比較し、HBV-RNA・DNAが、HBV感染暴露後により早く、かつ2倍程度高値に増加していた。他の各種センサー候補分子の恒常的ノックアウト細胞、強制発現細胞を同様の方法で樹立を試みたが作成不良であったため、一過性に各分子をノックダウン、強制発現する実験系による評価を行った。肝細胞株(HepG2、HuH7)において、ベクターおよびsiRNAを用いて、DDX41など各DNAセンサー候補分子を一過性に強制発現およびノックダウンした細胞を作成し、これらにHBV発現プラスミドをトランスフェクションし、レポーターアッセイを用いたTypeⅠおよびTypeⅢ IFN発現、ELISA法を用いて上清中のケモカイン・サイトカイン産生の評価、またHBV感染性に対する実験を遂行中である。
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