2016 Fiscal Year Research-status Report

癌細胞と腫瘍会合性マクロファージを標的とした光線力学的療法の癌性腹膜炎への応用

Research Project

Project/Area Number	16K19358
Research Institution	Nagoya City University
Principal Investigator	林則之名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 臨床研究医 (60745404)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2018-03-31
Keywords	光線力学的療法
Outline of Annual Research Achievements	光線力学的療法 (Photodynamic Therapy, PDT) は、光感受性物質が選択的に集積した腫瘍組織にレーザー光を照射し腫瘍細胞を選択的に破壊する治療法である。我々は、癌細胞が糖を取り込む性質を利用し、単糖であるグルコースやマンノースを光感受性物質であるクロリンに連結することにより、飛躍的な殺細胞効果を確認した。近年、癌間質に存在するマクロファージは腫瘍会合性マクロファージ（tumor-associated macrophage：TAM)と呼ばれており、癌細胞の増殖、浸潤、腫瘍血管新生、転移の促進、腫瘍免疫の抑制、癌幹細胞維持に関与することが報告され、癌治療における重要な標的の１つと認識されている。TAMにはマンノースレセプターが発現していることが知られており、MクロリンPDTは腫瘍間質に存在するTAMにも選択的に有意に殺細胞効果を示した。消化管癌の腹膜播種、癌性腹膜炎は標準的治療法がない難治性の病態である。腹水中細胞の約80％はマクロファージ（TAM)であることが知られている。MクロリンPDTを用いた腹膜播種の新たな治療法を検討し、PDTの抗腫瘍免疫誘導効果を含めたメカニズムを解明する。ヒト食道癌細胞株、ヒト胃癌細胞株、ヒト大腸癌細胞株HTを96wellプレートに培養し、薬剤を投与する。蛍光プレートリーダー(Spactra Max、Molecular Devices、Tokyo、Japan)を用いて薬剤の取り込みを計測した。また、薬剤投与後にLED機器（LEDR-660DL、Optocode Corporation:波長660nm 照射エネルギー30.8mW/cm2）の照射をし、数日後にWST8アッセイを用いて殺細胞効果を計測した。マウスの腹膜播種モデルを作成し、PDTの抗腫瘍効果を検討した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason マウスの腹膜播種モデルを作成し、PDTの抗腫瘍効果を検討しているが、適切な条件設定が決まらず難渋している。
Strategy for Future Research Activity	マウスの腹膜播種モデルを作成し、PDTの抗腫瘍効果を検討しているが、適切な条件設定を決定し、抗腫瘍効果を検討する。またマウス腹膜播種モデルを作成する。Mクロリンを腹腔内投与し、数時間から1日後に腹膜播種病変をとりだす。分光光度計を用いて、播種病変や肝臓や脾臓、腎臓など腹腔内の臓器へのMクロリンの集積を計測する。またPDTのTAMに対する効果を検討するため、MクロリンPDT施行後数日してから、開腹して腹膜播種病変を取り出す。ホルマリン固定後、マクロファージのマーカーの抗F4/80抗体やTAMマーカーで、マンノースレセプターである抗CD206抗体を用いて免疫染色し、TAMへの効果を検討する。光線力学的療法では一般に光感受性物質が特定波長光線により励起され、細胞内に細胞死を誘導するとされている。Mクロリンを投与後、660nmの赤色LED（LEDR-660DL、Optocode Corporation、Tokyo、Japan）を16 J/cm2照射し，reactive oxygen species (ROS) detection reagent (carboxy-H2 DCFDA) (Invitrogen)、Anti-LC3 （MBL，Nagoya，Japan）、Caspase-3 FITC（MBL）、PIでラベルしFACS Calibur (BD Biosciences、Tokyo、Japan)にて活性酸素の誘導、オートファジー、アポトーシス、ネクローシスを検討する。
Causes of Carryover	マウス実験が想定よりも時間がかかりその他の実験などをする時間がなくなってしまったため。
Expenditure Plan for Carryover Budget	レザフィリンの購入費用、細胞培養、実験試薬や実験器具（プラスティック器具など）、マウスの購入、および飼育などを中心とした消耗品費を予定した。研究成果は国内外の学会で発表予定であり、海外発表を視野に入れて経費を予定する。また英文誌に投稿予定のため、英文校閲料および論文投稿料も使用計画に組み入れた。